高濃度胰島素對腎小管上皮細胞白蛋白、葡萄糖重吸收的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）為糖尿病特征性微血管并發(fā)癥之一，但其發(fā)病機制復(fù)雜，且2型糖尿病腎病病理表現(xiàn)差異很大。傳統(tǒng)觀點認為其早期病變主要累及腎小球，并將微量白蛋白尿（microalbuminuria，MAU）作為早期臨床診斷指標，但越來越多的研究顯示糖尿病腎病在腎小球出現(xiàn)明顯損傷之前已存在腎小管及間質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能損傷，臨床主要表現(xiàn)為腎小管性蛋白尿及酶尿，甚至有研究在 STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中觀察到

2、早期白蛋白尿源于腎小管損傷導(dǎo)致的重吸收功能受損，而非源自腎小球。此外，腎小管間質(zhì)損傷與慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）導(dǎo)致的腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）下降及腎功能惡化的關(guān)系更加密切。因此，腎小管損傷在糖尿病腎病中的發(fā)生原因、機制及其結(jié)構(gòu)功能改變應(yīng)受到重視。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，78.2％的 DM患者在尿微量白蛋白升高前，已出現(xiàn)不同程度的腎小管功能異常，以高脂

3、飼料喂養(yǎng) OLETF大鼠誘導(dǎo)的2型糖尿病模型，在糖耐量減低期（impaired glucose tolerance，IGT）即已出現(xiàn)明顯的腎小管上皮細胞及間質(zhì)微血管的病理損傷，且尿中反映腎小管損傷的指標：尿視黃醇結(jié)合蛋白（RBP）、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶（NAG）和中性粒細胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白（NGAL）等排泄增加，但腎小球的結(jié)構(gòu)及反映其功能的血液、尿液生化指標未見明顯異常。那么在糖尿病前期，導(dǎo)致腎小管結(jié)構(gòu)及功能損傷的原因是什么？

4、胰島素抵抗/高胰島素血癥是CKD發(fā)生的獨立危險因素。有研究發(fā)現(xiàn)高胰島素對腎臟的損害在血糖升高前即已開始。IGT期一個重要的病理生理變化就是胰島素抵抗（insulin resistance，IR）及在此基礎(chǔ)上逐漸出現(xiàn)的代償性高胰島素血癥。這種代償升高的胰島素雖然有助于控制血糖，但過高的胰島素對腎臟等其它組織卻是有害的。那么在血糖尚未明顯升高之前，以胰島素抵抗/高胰島素血癥為主要特征的代謝紊亂是否會影響腎小管的結(jié)構(gòu)及功能，參與糖尿病腎病的發(fā)

5、生發(fā)展？腎臟在體內(nèi)糖代謝過程中也發(fā)揮重要作用。所有的腎小球細胞和腎小管細胞均存在胰島素受體。腎臟正常的胰島素信號通路依賴胰島素與其細胞膜受體的結(jié)合，并激活一系列細胞內(nèi)的級聯(lián)反應(yīng)而發(fā)揮效應(yīng)。因此我們推測，高濃度胰島素可能通過胰島素信號通路影響腎小管功能。本研究以大鼠近端腎小管上皮細胞株（NRK-52E）為研究對象，觀察在不同胰島素濃度及不同干預(yù)時間作用下，腎小管上皮細胞對白蛋白及葡萄糖重吸收的變化，以及介導(dǎo)白蛋白（megalin，cubi

6、lin）及葡萄糖（SGLT2，GLUT2，SGLT1， GLUT1）重吸收的受體表達的變化，同時探討 INS/IRS-1/PI3K/Akt通路在其中的參與作用。
　　方法：⑴MTT法檢測不同濃度的胰島素對NRK-52E細胞活力的影響，并結(jié)合胰島素的生理濃度以確定其干預(yù)濃度，并進一步分為對照組、胰島素低濃度組、中等濃度組及高濃度組。⑵不同濃度的胰島素作用于 NRK-52E細胞24h后，運用免疫熒光法、熒光定量PCR（Fluoresc

7、ent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）和蛋白免疫印跡（Western Blot，WB）技術(shù)分別從基因和蛋白水平檢測megalin，cubilin，SGLT2，GLUT2， SGLT1及GLUT1受體表達量的變化。⑶以高濃度胰島素干預(yù)細胞不同時間（0，1h，6h，12h，24h，48h）后，分別用免疫熒光、熒光定量PCR和Western Blot法檢測megalin，cubilin，SGLT2， GLUT2，SGLT1及

8、GLUT1受體表達量的變化。⑷應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察NRK-52E細胞吞飲異硫氰酸四甲基羅丹明標記的牛血清白蛋白(TRITC-albumin)的變化。⑸應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察NRK-52E細胞吞飲熒光標記2-脫氧葡萄糖（2-NDBG）的變化。⑹應(yīng)用FQ-PCR和Western Blot法檢測在不同濃度的胰島素及不同干預(yù)時間作用下，NRK-52E細胞IRS-1、PI3K及Akt的變化。⑺設(shè)置對照組、PI3K抑制劑組與高濃度胰島素干預(yù)組

9、，應(yīng)用免疫熒光法觀察各組對 TRITC-albumin、2-NDBG的重吸收及各受體蛋白的變化趨勢并進行比較。
　　結(jié)果：①結(jié)合MTT法檢測結(jié)果，確定胰島素干預(yù)濃度：0 ng/ml（對照組），5ng/ml（低濃度干預(yù)組，相當于生理濃度），10 ng/ml（中等濃度干預(yù)組），50ng/ml（高濃度干預(yù)組）。②不同胰島素濃度干預(yù)下，NRK-52E細胞的megalin與cubilin表達量均在低濃度干預(yù)組最大（P<0.05），以后逐漸減

10、少，至高濃度干預(yù)組表達最少。二者在干預(yù)時間為0-6h逐漸增加，至6h最大（P<0.05），此后逐漸減少，至48h最少。③NRK-52E細胞對白蛋白的攝取與胰島素濃度有關(guān)，在胰島素干預(yù)濃度為5ng/ml時最大（P<0.05），此后隨干預(yù)濃度的增加，攝取量逐漸減少。④不同胰島素濃度干預(yù)下，NRK-52E細胞SGLT2與GLUT2的表達呈濃度依賴性增加，GLUT1僅在高濃度胰島素干預(yù)組表達量增加，SGLT1未見明顯變化。不同干預(yù)時間條件下，各

11、葡萄糖轉(zhuǎn)運體的最高表達量均出現(xiàn)在干預(yù)6h（P<0.05），此后雖有減少，但仍較對照組高。⑤NRK-52E細胞對葡萄糖的吞飲量隨胰島素濃度的增加而增加。⑥高濃度胰島素條件下，腎小管上皮細胞的胰島素信號通路 IRS-1、PI3-K及Akt的活性受到抑制（P<0.05）。
　　結(jié)論：⑴高濃度胰島素條件下，腎小管上皮細胞胰島素信號通路 IRS-1/PI3-K/Akt受到抑制。⑵高濃度胰島素通過抑制信號通路 IRS-1/PI3-K/Akt，