自噬對(duì)組蛋白介導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是ICU常見病之一，發(fā)病率正逐年增高。研究顯示腎小管細(xì)胞凋亡為其重要發(fā)病機(jī)理之一。組蛋白是真核生物染色質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)蛋白，然而，有研究提出細(xì)胞外組蛋白也是一種內(nèi)源性損傷相關(guān)模式分子(damage associated molecular patterns，DAMPs)，其在AKI發(fā)病機(jī)理中有著重要作用。研究顯示，通過小鼠腎動(dòng)脈注射組蛋白，可以引起中性粒細(xì)胞浸潤、微血管滲漏、腎臟炎

2、癥反應(yīng)以及AKI病理改變。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞外組蛋白可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡。
　　自噬是指膜包裹胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器等進(jìn)行降解的一種動(dòng)態(tài)過程，起維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及更新細(xì)胞器的作用。同時(shí)，自噬也是一種應(yīng)激調(diào)控機(jī)制，許多AKI模型中已證實(shí)自噬是上調(diào)的。有大量研究提出自噬可以抑制凋亡，比如在饑餓或生長因子缺乏時(shí)，自噬可以抑制凋亡保證細(xì)胞存活。研究報(bào)道，在缺血/再灌注腎損傷小鼠模型，自噬水平提高，而用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyla

3、denine，3-MA)或者氯喹預(yù)處理，腎細(xì)胞凋亡增加。目前已經(jīng)明確應(yīng)激情況下產(chǎn)生的過多反應(yīng)活性氧類(Reactive oxygen species，ROS)可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。自噬是否通過減少ROS的產(chǎn)生從而抑制組蛋白誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)凋亡尚未清楚，本實(shí)驗(yàn)將針對(duì)此方面進(jìn)行觀測(cè)與探討。
　　研究目的：
　　1.明確組蛋白是否可以誘導(dǎo)HK-2凋亡及自噬;
　　2.探討自噬是否通過減少ROS產(chǎn)生來抑制組蛋白介

4、導(dǎo)的HK-2凋亡。
　　研究方法：
　　1.以不同濃度組蛋白刺激HK-2，分別應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和免疫印跡法檢測(cè)HK-2凋亡情況和自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表達(dá)的情況，初步了解組蛋白對(duì)HK-2凋亡和自噬的影響。
　　2.以自噬抑制劑3-MA預(yù)處理后，分別應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和免疫印跡法檢測(cè)組蛋白誘導(dǎo)的HK-2凋亡情況和caspase3活化情況，明確自噬對(duì)凋亡的作用。
　　3.以自噬抑制劑3-MA預(yù)處理后，應(yīng)用流式

5、細(xì)胞術(shù)檢測(cè)組蛋白誘導(dǎo)的HK-2的ROS生成量，進(jìn)而明確自噬是否通過減少ROS產(chǎn)生從而抑制組蛋白介導(dǎo)的HK-2凋亡。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　使用IBM SPSS21統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以(X)±S表示，多組間均值比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間均值兩兩比較采用LSD法或Dunnett's T3法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　1.不同濃度組蛋白對(duì)HK-2凋亡的影響
　　流式結(jié)果

6、顯示，不同濃度組蛋白對(duì)HK-2凋亡的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=57.497，P＜0.01)。組間兩兩比較顯示：與對(duì)照組(7.94±1.78％)比較，組蛋白25、50、100ug/ml組（17.31±4.41％，27.98±2.45％，53.15±7.12％）隨著濃度升高而出現(xiàn)早期和晚期凋亡所占的比例依次升高(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)。
　　2.不同濃度組蛋白對(duì)HK-2Beclin1和LC3Ⅱ表達(dá)的影響
　　灰度

7、分析提示不同濃度組蛋白對(duì)HK-2Beclin1和LC3Ⅱ表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.279、4.815，P＜0.05)。與對(duì)照組比較，各濃度組蛋白組LC3Ⅱ、Beclin1表達(dá)水平均升高(P＜0.05)。
　　3.3-MA對(duì)組蛋白誘導(dǎo)的HK-2凋亡的影響
　　流式及Western blotting結(jié)果分別顯示，單純3-MA處理對(duì)HK-2凋亡率及caspase3活化水平無影響(P＞0.05)，但顯著提高了組蛋白誘導(dǎo)的HK-2