核心巖藻糖基化修飾在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中對(duì)自噬的影響.pdf

1、目的：
　　探討轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導(dǎo)近端腎小管上皮細(xì)胞(human renal proximal tubular epithelial cells，HK-2)轉(zhuǎn)分化過程中，α-1,6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(α-1,6 fucosyl trans ferase，F(xiàn)ut8)催化核心巖藻糖基化修飾對(duì)腎小管上皮細(xì)胞自噬的影響。
　　方法:
　　(1)在大連醫(yī)科

2、大學(xué)附屬第一醫(yī)院2015年1月至2016年12月腎活檢確診為原發(fā)性IgA腎病的120例患者中，按Banff07腎間質(zhì)纖維化程度分級(jí)方法，分成無纖維化、輕度、中度、重度四組，每組隨機(jī)選取10例患者，共40例患者，利用電子顯微鏡計(jì)數(shù)腎小管上皮細(xì)胞中的自噬體個(gè)數(shù)，并對(duì)各組的平均視野下自噬體數(shù)量進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。（2）對(duì)四組患者的腎活檢病理組織進(jìn)行自噬相關(guān)蛋白beclin-1免疫組化染色，比較分析各組beclin-1的表達(dá)強(qiáng)度差異，進(jìn)一步確定IgA

3、腎病各組自噬活性的變化趨勢(shì)。(3)免疫熒光雙重染色：體外培養(yǎng)人的永生化HK-2細(xì)胞，并分為兩組：正常對(duì)照組（CON組）：10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)48h;TGF-β1刺激組（TGF組）：向不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，加入終濃度為10ng/ml的TGF-β1刺激因子孵育細(xì)胞48h；對(duì)兩組分別進(jìn)行自噬相關(guān)蛋白beclin-1與肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）免疫熒光雙重染色，并比較分析。(4)免疫印跡

4、法檢測(cè)：體外培養(yǎng)人的永生化HK-2細(xì)胞并分五組，CON組,用含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)48h;Fut8-siRNA沉默組,即用siRNA-mate轉(zhuǎn)染試劑將 Fut8-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn) HK-2細(xì)胞，再用10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)48h；TGF-β1刺激組（TGF組），向不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中加入終濃度為10ng/ml的TGF-β1刺激細(xì)胞48h;TGF-β1刺激+Fut8-siRNA沉

5、默組（TGFF組）,將Fut8-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)HK-2細(xì)胞，抑制FUT8的表達(dá)，再加入終濃度為10ng/ml的TGF-β1孵育細(xì)胞48h；TGF-β1+Mock組（TGFM組），將對(duì)照的無序 siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn) HK-2細(xì)胞，再向不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中加入終濃度為10ng/ml的TGF-β1刺激細(xì)胞48h；用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)各組α-SMA、FUT8和 beclin-1的表達(dá)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　

6、　(1)電鏡下對(duì)IgA腎病各組觀察，腎間質(zhì)無纖維化組自噬體平均個(gè)數(shù)為0.880±0.161、輕度組自噬體平均個(gè)數(shù)為1.470±0.133、中度組自噬體平均個(gè)數(shù)為2.030±0.200、重度組自噬體平均個(gè)數(shù)為1.560±0.171，與無纖維化組相比，輕度、中度、重度組自噬體數(shù)量明顯增加，且P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中中度組自噬體平均數(shù)量最多，重度組自噬體平均數(shù)量少于中度組。（2）IgA腎病各組通過免疫組化染色可見：在無纖維化組的1

7、0例患者中，beclin-1呈弱表達(dá)的例數(shù)占所在組70%；輕度組的10例患者中beclin-1有6例呈中等表達(dá)，占所在組例數(shù)的60%；中度組的10例患者beclin-1高表達(dá)例數(shù)占60%；重度組的10例患者中有5例中等表達(dá)，占總體的50%，高表達(dá)組有3例，占本組30%；與無纖維化組相比，輕度、中度、重度組beclin-1表達(dá)明顯上調(diào)，其中中度組beclin-1高表達(dá)比例明顯高于輕度、重度組。（3）為了檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化與自噬體之間

8、的關(guān)系，我們通過免疫熒光雙染的方法檢測(cè)α-SM A與beclin-1的表達(dá)，結(jié)果顯示：與CON組相比，TGF組中α-SMA熒光強(qiáng)度明顯增加，而beclin-1熒光強(qiáng)度明顯減弱，免疫熒光結(jié)果說明TGF-β1刺激腎小管上皮細(xì)胞對(duì)自噬具有抑制作用。（4）為了驗(yàn)證熒光結(jié)果及核心巖藻糖基化修飾與自噬體之間的關(guān)系，我們進(jìn)行了免疫印記的半定量分析，其結(jié)果顯示：在CON組中α-SMA蛋白呈低表達(dá)，beclin-1呈中等表達(dá)； Fut8-siRNA沉默組

9、中α-SMA蛋白表達(dá)弱于CON組，而beclin-1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.01）；與CON組相比，TGF組中α-SMA蛋白表達(dá)增加（P<0.01），beclin-1表達(dá)減少（P<0.01）；與TGF組相比，在TGFF組中α-SMA表達(dá)明顯較少，而beclin-1表達(dá)明顯增加；TGFM組中的α-SMA及beclin-1蛋白表達(dá)基本與TGF組相似，免疫印跡結(jié)果說明，F(xiàn)UT8催化的TGF-β受體核心巖藻糖基化對(duì)自噬具有抑制作用。