腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的干細(xì)胞機(jī)制研究.pdf

1、腎小管間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎功能衰竭(end stage renal disease，ESRD)的主要病理基礎(chǔ)，決定了腎臟纖維化的發(fā)展進(jìn)程。因此研究腎小管間質(zhì)纖維化的機(jī)制已經(jīng)成為了腎臟病界研究的熱點(diǎn)。
　　 研究表明，腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial to mesenchymal trans-differentiation，E

2、MT)為RIF發(fā)生的重要機(jī)制。上皮細(xì)胞在特定的病理情況下，可通過上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞間的逆向分化成為具有多向分化潛能的間充質(zhì)細(xì)胞，即EMT。在這一過程中，腎小管上皮細(xì)胞失去上皮細(xì)胞的表型，獲得新的間充質(zhì)細(xì)胞的特點(diǎn)，如鈣粘素(E-cadherin)的表達(dá)減少、重新表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)。根據(jù)本課題組前期試驗(yàn)研究結(jié)果，上皮細(xì)胞逆向分化過程中一過性表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物CD133，本文推斷

3、腎小管上皮細(xì)胞逆向分化可能存在干細(xì)胞機(jī)制：上皮細(xì)胞逆向分化為間充質(zhì)細(xì)胞，間充質(zhì)細(xì)胞獲得組織干細(xì)胞潛能，在后續(xù)信號(hào)的特定作用下，分別向腎小管細(xì)胞，抑或肌成纖維細(xì)胞分化，起積極/消極的修復(fù)作用。
　　 目的：為了進(jìn)一步研究腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中是否有干細(xì)胞生成，試圖闡明EMT的可能干細(xì)胞機(jī)制；探討終止EMT的策略和方法，為最終阻止腎纖維化提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)和理論基礎(chǔ)。本研究在體外建立EMT細(xì)胞模型，重點(diǎn)研究干細(xì)胞標(biāo)記物Oct-4、C

4、D24基因在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的表達(dá)情況。
　　 方法：采用10-9mol/L血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)刺激體外培養(yǎng)的正常大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)。建立腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)分為空白組，AngⅡ誘導(dǎo)組，每組設(shè)3復(fù)孔，共培養(yǎng)3d。用倒置相差顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)。AngⅡ誘導(dǎo)組設(shè)10個(gè)刺激時(shí)間點(diǎn)，在刺激的不同時(shí)間點(diǎn)提取細(xì)胞的RNA和蛋白質(zhì)，分別采用RT

5、-PCR和Western blot 方法檢測(cè)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志α-SMA、上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin、胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物Oct-4、腎臟干細(xì)胞標(biāo)記物CD24 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，并研究其時(shí)效性表達(dá)變化規(guī)律。制備各個(gè)刺激時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞爬片，采用細(xì)胞間接免疫熒光法定性檢測(cè)α-SMA、E-cadherin、Oct-4、CD24的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：培養(yǎng)3d后，AngⅡ誘導(dǎo)組細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，從原有典型的上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形

6、類似成纖維細(xì)胞的形態(tài)，失去原有的細(xì)胞極性，微絨毛結(jié)構(gòu)基本丟失；并出現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞所具有的微絲束和致密體。RT-PCR結(jié)果顯示，AngⅡ刺激10min時(shí)開始產(chǎn)生α-SMA，隨AngⅡ刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，α-SMA的表達(dá)逐漸增加，顯著高于對(duì)照組，差異有顯著性意義(P＜0.05)。而E-cadherin的表達(dá)逐漸下調(diào)，顯著低于對(duì)照組，差異有顯著性意義(P＜0.05)。Western blot和細(xì)胞免疫熒光結(jié)果一致，α-SMA蛋白在刺激1h開始表達(dá)

7、，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸增加，而E-cadherin蛋白的表達(dá)逐漸下調(diào)，與mRNA表達(dá)趨勢(shì)一致。α-SMA、E-cadherin 的表達(dá)變化存在時(shí)間依賴性方式。提示腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化細(xì)胞模型成功建立。AngⅡ刺激25min，NRK-52E細(xì)胞開始表達(dá)Oct-4 mRNA和CD24 mRNA，1h表達(dá)量最高，4h后消失。Westem blot和細(xì)胞免疫熒光顯示相似的變化規(guī)律，AngⅡ刺激1h，NRK-52E細(xì)胞開始表達(dá)Oct-4和CD2

8、4蛋白，4h表達(dá)量最高。而空白對(duì)照組均不表達(dá)Oct-4和CD24。刺激組Oct-4和CD24的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Oct-4、CD24表達(dá)的規(guī)律一致，表達(dá)量呈時(shí)間依賴。
　　 結(jié)論：
　　 (1)成功建立腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化細(xì)胞模型。
　　 (2)在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化細(xì)胞模型中，上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin表達(dá)逐漸下調(diào)，間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志α-SMA表達(dá)逐漸上調(diào)，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生