高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及ILK的表達(dá).pdf

1、研究背景：腎小管問(wèn)質(zhì)病變是糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)進(jìn)展為終末期腎臟病(end-stage renal disease，ESRD)的重要病理基礎(chǔ)，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在腎間質(zhì)過(guò)量堆積是其基本病理特征。目前認(rèn)為腎間質(zhì)ECM主要由肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MyoF)分泌。研究發(fā)現(xiàn)在病理?xiàng)l件下，腎小管上皮細(xì)胞可發(fā)生小管上皮細(xì)胞．肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(t

2、uLbular epithelial-myofibroblast transdifferentiation，TEMT)，即喪失原有的上皮細(xì)胞表型特征，而獲得MyoF的新特征，是腎間質(zhì)MyoF的重要來(lái)源。眾多體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)表明TEMT參與了許多慢性腎臟疾病腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生和發(fā)展。本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)纖維化過(guò)程中存在TEMT，但是體外高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)分化?目前尚不十分清楚。 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因

3、子-β1(tansforming growth factor beta-1，TGF-β1)是TEMT的重要啟動(dòng)和促進(jìn)因子。TGF-β1的生物學(xué)作用廣泛而復(fù)雜，具有正面和負(fù)面的多樣效應(yīng)。單純抑制TGF-β1這一上游因子，則可能在抑制TEMT的同時(shí)引起其他不利的負(fù)效應(yīng)。于是，尋找作用更特異、有效的下游因子或環(huán)節(jié)，成為新近研究的關(guān)注熱點(diǎn)。整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)是1996年發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/

4、蘇氨酸蛋白激酶，具多功能蛋白激酶活性。ILK作為是TGF-β1下游重要的效應(yīng)分子，在TEMT過(guò)程中起重要作用，是TEMT關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一。 ILK也是細(xì)胞外FN(fibronectin，F(xiàn)N)積聚的重要調(diào)節(jié)因子。本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)糖尿病大鼠腎小管上皮細(xì)胞ILK表達(dá)增高，且隨病程進(jìn)展而遞增，但是體外高糖環(huán)境下人腎小管上皮細(xì)胞ILK表達(dá)如何?目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。目的：以高糖模擬糖尿病條件，體外觀察高糖環(huán)境下人近端腎小管

5、上皮細(xì)胞(HK-2)是否發(fā)生TEMT及ILK的表達(dá)變化，探討ILK在TEMT中的意義及機(jī)制。 方法：應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，按下列實(shí)驗(yàn)條件分組培養(yǎng)人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)：正常對(duì)照組(N組)用低糖(5.5mM D-葡萄糖)培養(yǎng)液；高糖組(H組)用高糖(30mM D-葡萄糖)培養(yǎng)液；甘露醇組(M組)用含24.5mM D-甘露醇+5.5mM D-葡萄糖的培養(yǎng)液(滲透壓與高糖組相近)。三組均在無(wú)血清條件下培養(yǎng)，分別在實(shí)驗(yàn)作用的0h，

6、12h，24h，48h，72h收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)，Western Blotting方法檢測(cè)HK-2中α-SMA、 E-cadherin、ILK及FN的蛋白表達(dá)水平的時(shí)間效應(yīng)。 結(jié)果：1．N組和M組各時(shí)間點(diǎn)HK-2細(xì)胞E-cadherin表達(dá)均較強(qiáng)，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間變化無(wú)明顯差異(P>0.05)；H組E-cadherin表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)減弱，72h表達(dá)最弱，呈時(shí)間依賴性

7、(P<0.05)。2.N組和M組各時(shí)間點(diǎn)HK-2細(xì)胞幾乎無(wú)α-SMA表達(dá)，F(xiàn)N表達(dá)很弱，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間無(wú)明顯差異(P>0.05)；H組α-SMA及FN表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)增加，72h達(dá)高峰，呈時(shí)間依賴性(P<0.05)。3.N組和M組各時(shí)間點(diǎn)HK-2細(xì)胞ILK表達(dá)微弱，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間無(wú)明顯差異(P>0.05)；H組ILK表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)增加，72h達(dá)高峰，呈時(shí)間依賴性(P<0.05)。各時(shí)間點(diǎn)HK-2細(xì)胞中，ILK與E-cadher

8、in的蛋白表達(dá)量成負(fù)相關(guān)(r=-0.85，P<0.01)：ILK與α-SMA和FN的蛋白表達(dá)量成正相關(guān)(r=0.84，P<0.01；r=0.93，P<0.01)。 結(jié)論：1．高糖環(huán)境下，體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞E-cadherin表達(dá)減少，α-SMA、FN表達(dá)增加，表明在體外高糖獨(dú)立因素能誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。2．高糖環(huán)境下，HK-2細(xì)胞ILK表達(dá)上調(diào)，并與E-cadherin變化呈負(fù)相關(guān)，與α-SMA、FN變化呈正相關(guān)；I