FoxO1對高糖誘導下腎小管上皮細胞線粒體自噬的影響及機制研究.pdf

1、背景:
　　糖尿病腎病( diabetes nephropathy，DN)是糖尿病最為常見的微血管并發(fā)癥之一。目前，DN的發(fā)病復雜，其機制尚不完全清楚。既往認為腎小球損傷是在糖尿病腎病發(fā)展為終末期腎病（ESRD）過程中最重要的病理變化。然而，腎小管及腎間質占全部腎臟體積的90％左右，腎小管細胞的損傷在DN發(fā)病過程中起著同樣重要作用。越來越多的證據(jù)表明，在腎小球濾過正常的時候，腎小管性蛋白尿已經(jīng)可以在尿液中檢測到，這就說明腎小管在D

2、N發(fā)病機制中獨立于腎小球的改變，腎小管細胞受損是DN早期的原始改變，阻斷腎小管近端上皮細胞受損更接近于治療靶點的源頭。
　　自噬(autophagy)是細胞通過溶酶體降解自身受損細胞器以及大分子物質的過程，在腎臟疾病中起著重要的作用。自噬分為選擇性自噬和非選擇性自噬。其中，機體通過選擇性自噬清除各種細胞器如線粒體、內質網(wǎng)、過氧化物酶體等，分別稱為線粒體自噬、內質網(wǎng)自噬、過氧化物酶體自噬等。正常情況下，細胞自噬功能處于一個正常的基礎

3、水平，來維持細胞正常的生理功能。若機體自噬出現(xiàn)異常，則可能會導致腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展。目前，調控腎小管上皮細胞線粒體自噬的機制不太清楚。
　　叉頭狀轉錄調節(jié)因子O1(forkhead transcription factorsof the O class1)在抗氧化應激、轉錄翻譯、糖脂代謝等方面具有重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1可以調節(jié)線粒體自噬，減少ROS的過度釋放，進而改善糖尿病足細胞氧化應激損傷。腎小管細胞中的研

4、究發(fā)現(xiàn)，高糖會導致腎小管上皮細胞自噬功能的下降，可能與DN的發(fā)病機制可能有密切的關系。BNIP3屬于Bcl-2家族蛋白中的BH3-only亞家族，研究發(fā)現(xiàn)BNIP3可以激活線粒體自噬，既往研究發(fā)現(xiàn)在急性腎損傷的腎近曲小管細胞中，F(xiàn)oxOs可以通過下游靶基因Bnip3抑制mTORC1的作用，開始自噬，促進凋亡。由此我們推斷，F(xiàn)oxO1/Bnip3通路在糖尿病腎病的腎小管中也可能發(fā)揮重要作用。FoxO1可以通過上調Bnip3的表達，啟動線粒

5、體自噬，減少損傷。
　　目的：
　　在前期研究工作的基礎上，結合國內外最新研究成果，擬通過體內和體外在高糖條件下，觀察調節(jié)FoxO1的表達對線粒體自噬和在近端腎小管損傷中的影響，并探究其是否通過激活下游BNIP3的表達發(fā)揮作用，為DN的防治提供新的思路。
　　方法：
　　動物實驗部分，利用雄性C57BL/6野生小鼠和同型FoxO1過表達的轉基因小鼠，通過STZ誘導建立糖尿病小鼠模型。實驗小鼠分為4組，普通小鼠對照

6、組（NG）、轉基因小鼠正常組（TG）、普通糖尿病小鼠（DM）、轉基因糖尿病小鼠（TG-DM）。每組各8只。12周末小鼠心臟取血檢測血清肌酐、尿素氮；各組代謝籠收集24h尿檢測24h尿總蛋白、尿微量白蛋白；尾靜脈取血測血糖，小鼠麻醉后，迅速剝離出腎臟，其中放入4%戊二醛中固定用于電子顯微鏡的檢查，置于4%多聚甲醛中固定用于石蠟切片，剩余放入凍存管于液氮中冷凍，Western blot檢測FoxO1表達水平及磷酸化狀態(tài)（p-FoxO1）、B

7、NIP3、LC3、P62的蛋白水平；免疫組化檢測FOXO1、BNIP3在各組大鼠腎組織中的表達。透射電鏡、HE染色、Massion染色觀察腎臟的病理學變化。
　　使用CRISPR/Cas9技術在腎小管上皮細胞上過表達/敲除FoxO1，使用BNIP3 siRNA質粒轉染。
　　細胞實驗分組如下：
　?、僬Ｌ菨舛冉M(NG，5.6mmol/L)；
　?、诟咛牵℉G，25mmol/L)；
　　③高糖+FoxO1上

8、調組（HG+KI）；
　?、蹷nip3 siRNA轉染組（HG+KI＋Bnip3 siRNA）。
　　各組處理后實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測各組FoxO1、BNIP3、LC3、P62 mRNA的表達水平。Western blot檢測FoxO1表達水平及磷酸化狀態(tài)（p-FoxO1）、BNIP3、LC3、P62的蛋白水平；免疫熒光化學檢測各組細胞 FoxO1和 BNIP3的表達；流式細胞儀檢測各組 ROS的生成率；檢

9、測各組細胞ATP的生產(chǎn)率。
　　結果：
　　1.小鼠各組腎臟腎小管上皮細胞中FoxO1的表達以及活性的改變，與NG組相比，DM組小鼠腎臟腎小管上皮細胞中 FoxO1蛋白水平?jīng)]有統(tǒng)計學差異（P>0.05）,p-FoxO1/FoxO1蛋白水平增高（P<0.05），與DM組相比，TG-DM組FoxO1蛋白水平增高（P<0.05），p-FoxO1/ FoxO1水平降低（P<0.05）。表示高糖可以誘導FoxO1轉錄活性下降,轉基因小

10、鼠FoxO1上調成功。
　　2.動物驗證 FoxO1對BNIP3通路的影響，與NG組相比，DM組 BNIP3蛋白水平降低，LC3、P62蛋白水平均明顯升高（P<0.05）,與DM組相比，TG-DM組BNIP3蛋白水平升高，LC3、P62蛋白水平均降低（P<0.05）。HE和掃描電鏡染色顯示TG-DM組腎小管結構等病變均較 DM組有所減輕。
　　3.細胞各組FoxO1表達以及活性的改變:與NG組相比，HG組FoxO1 mRNA

11、及蛋白水平無明顯變化，p-FoxO1/FoxO1水平增高（P<0.05）。HG+KI組較HG組FoxO1 mRNA及蛋白水平升高，p-FoxO1/FoxO1水平降低（P<0.05）。說明高糖可以誘導 FoxO1轉錄活性下降，CRISPR/Cas9技術在腎小管上皮細胞過表達FoxO1成功。
　　4.細胞中FoxO1對BNIP3通路的影響:與NG組相比，HG組BNIP3 mRNA及蛋白水平降低，LC3、P62 mRNA及蛋白水平均升高

12、（P<0.05），與HG組相比，HG+KI組BNIP3 mRNA及蛋白水平升高，LC3、P62 mRNA及蛋白水平均有所降低（P<0.05）。轉染 BNIP3敲除的質粒后，上調FoxO1對上述指標的影響被阻斷。
　　5.與NG組相比，HG組明顯升高腎小管上皮細胞中ROS水平（P<0.05），與HG組相比，HG+KI組可顯著抑制高糖的影響（ P<0.05），轉染BNIP3敲除的質粒后，上調FoxO1對上述指標的影響被阻斷。