人腦惡性膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)和VEGF誘導(dǎo)其三維成型的研究.pdf

1、該研究基于對(duì)腫瘤源性內(nèi)皮細(xì)胞異質(zhì)性和惡性膠質(zhì)瘤微血管的豐富性,分離、純化了人腦惡性膠質(zhì)瘤源性微血管內(nèi)皮細(xì)胞(GDMEC),并進(jìn)行了傳代培養(yǎng);利用三維細(xì)胞培養(yǎng)模型初步觀察了血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)對(duì)GDMEC在三維膠原基質(zhì)中小管樣結(jié)構(gòu)(tubule-like structure)形成的作用.主要結(jié)果與結(jié)論如下:1.采用胰酶、膠原酶聯(lián)合消化法,分離獲得人腦惡性膠質(zhì)瘤微血管片段;利用MACS MicroBeads免疫磁珠內(nèi)皮細(xì)胞分選系統(tǒng),

2、獲得高純度、可連續(xù)傳代的GDMEC.具體方法是:膠質(zhì)瘤組織經(jīng)胰酶、膠原酶消化后的微血管片段接種在明膠包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,經(jīng)8~10天培養(yǎng)以富集內(nèi)皮細(xì)胞.2.應(yīng)用光鏡、透射電鏡和免疫細(xì)胞化學(xué)等技術(shù)對(duì)所獲內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了鑒定.純化GDMEC呈單層片狀生長、互不重疊,可見到有孔內(nèi)皮細(xì)胞.透射電鏡除見到內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征包括Weibel-Palade小體、豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器外,還見到較多微管和微絲,后者以周邊部明顯.FⅧ-Rag免疫細(xì)胞化

3、學(xué)染色顯示細(xì)胞漿及核周呈陽性反應(yīng).形態(tài)學(xué)及免疫化學(xué)結(jié)果表明所獲GDMEC具內(nèi)皮細(xì)胞屬性.3.建立并利用GDMEC三維細(xì)胞培養(yǎng)模型,比較觀測(cè)了所獲GDMEC和內(nèi)皮樣細(xì)胞ECV304在三維膠原基質(zhì)中小管樣結(jié)構(gòu)形成情況.結(jié)果顯示,GDMEC細(xì)胞伸展、變形呈扁平狀;細(xì)胞之間相互連接,形成小管樣結(jié)構(gòu);不同濃度的VEGF刺激后可加速小管樣結(jié)構(gòu)的形成、增加形成數(shù)量,并促進(jìn)小管樣結(jié)構(gòu)進(jìn)一步形成毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò),而ECV304細(xì)胞缺乏這一特性,提示該研究所

4、獲得GDMEC更適合體外研究腫瘤血管生成之用.上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,雙酶消化法和免疫磁珠細(xì)胞分選技術(shù)相結(jié)合能有效地獲得高純度GDMEC,且具可傳代性、對(duì)生長因子VEGF具高度敏感的特性.該研究所獲得的內(nèi)皮細(xì)胞為GDMEC進(jìn)一步克隆建株奠定了基礎(chǔ),所摸索出的GDMEC分離和純化方法為建立其它實(shí)體瘤內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體系也積累了經(jīng)驗(yàn).該實(shí)驗(yàn)不僅有助于認(rèn)識(shí)腫瘤環(huán)境誘導(dǎo)下的內(nèi)皮細(xì)胞異質(zhì)性,而且為深入研究腫瘤血管生成和抗血管生成治療提供了更為適用的實(shí)驗(yàn)材料