Nogo-B在人膠質(zhì)瘤組織和微血管內(nèi)皮細(xì)胞中差異表達(dá)的研究.pdf

1、Nogo-B蛋白是一類中樞髓鞘源性抑制蛋白,是抑制中樞神經(jīng)元軸突再生的抑制因子,分布廣泛,在神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)。在外周組織如血管組織、腎臟、肺臟、軟骨、腎臟、皮膚、脾中也有表達(dá)。 組織損傷后Nogo-B的作用首先表現(xiàn)在參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生抑制。Neuron雜志2003年發(fā)表了3篇有關(guān)Nogo基因缺陷小鼠文章。Strittmatter和同事發(fā)現(xiàn)Nogo-A/Nogo-B缺陷小鼠的軸突再生能力改善；Tessier-Lavigne團(tuán)

2、隊分別制造出Nogo-A,B,C3亞型同時缺失模型和Nogo-A,B缺失模型,未發(fā)現(xiàn)軸突再生改善；Simonen等人報道伴隨Nogo-A缺陷小鼠軸突生長抑制作用降低,中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Nogo-B表達(dá)上調(diào)。雖然以上文獻(xiàn)報道有關(guān)Nogo-B功能略有矛盾,但是在某種程度上證明了Nogo-B參與中樞系統(tǒng)損傷后再生。 2004年Nature Medicine上的一篇文章充分揭示了Nogo-B限制外周血管損傷后的再生。Acavedo等人采用質(zhì)

3、譜分析和RT-PCR等技術(shù)首先發(fā)現(xiàn)血管的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中Nogo-B高表達(dá),進(jìn)而將其功能片段分別引入這兩個細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)Nogo-B促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和抑制平滑肌細(xì)胞的再生,采用Nogo-B缺失小鼠研究發(fā)現(xiàn),股動脈損傷后平滑肌細(xì)胞再生活躍造成血管閉塞,轉(zhuǎn)染Nogo-B后平滑肌增生減弱。國內(nèi)Jing-Wei Pan等在2007年發(fā)表了Nogo-B和主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)系的文章。文章報道在粥樣硬化斑塊組織中Nogo-B的mRNA和蛋白表達(dá)

4、下調(diào)和動脈瘤的形成密切相關(guān),Nogo-B在其中起保護(hù)血管的作用。在國外有研究建立了體外細(xì)胞模型,發(fā)現(xiàn)了Nogo-B更值得關(guān)注的功能,其可溶性N端片段對于內(nèi)皮細(xì)胞具有顯著的類似VEGF樣趨化修復(fù)作用,但對于血管平滑肌細(xì)胞有阻斷PDGF誘導(dǎo)的增生作用。該發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了巨大影響,Rmnes EW在Nature Medicine上作出"Nogo-B為血管病變安裝了閘門”的評論,高度評價了Nogo-B在血管病變中的重要功能。 但是Nogo-B

5、在血管病變損傷中的作用機制仍未能完全明確。英國Rousseau S等的意外發(fā)現(xiàn)表明,Nogo-B為SAPK2a/p38a通路中MAPKAP-K2的磷酸化底物,提示Nogo-B活性與MAPKs通路密切相關(guān)。MAPKs信號通路由一組以級聯(lián)方式依次活化的絲/蘇氨酸蛋白激酶組成,將與細(xì)胞膜受體結(jié)合的胞外刺激逐級放大并傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi),調(diào)節(jié)效應(yīng)分子參與細(xì)胞生長、分化和凋亡等階段的病理生理活動。其中P38和P42/44已被證明在內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和平滑肌細(xì)

6、胞增殖中起重要作用。Nogo-B在MAPKs通路中的功能為Nogo-B的機制研究提供了線索,提示Nogo-B對血管的保護(hù)作用與MAPKs通路有關(guān)。 除了對調(diào)節(jié)血管生成的作用外,Nogo-B對腫瘤起了到底什么作用?有文獻(xiàn)報道Nogo基因表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡,這個基因在惡性腫瘤細(xì)胞系中有一個很強的促凋亡傾向,例如SaOS-2,HT-1080等。這些發(fā)現(xiàn)表明Nogo基因是一種新型促凋亡基因。研究表明這些凋亡蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,它編碼內(nèi)質(zhì)

7、網(wǎng)reticulum靶蛋白,其通路和目前已知的前凋亡蛋白不同,在腫瘤細(xì)胞中該基因的丟失非常明顯。盡管研究表明Nogo-B基因?qū)е碌蛲?它不和目前已知的任何一種凋亡相關(guān)基因或者功能域同源。相反,它有獨特的功能基序,即在它的C末端有一個重復(fù)賴氨酸內(nèi)質(zhì)保守基序,這個抗凋亡作用與該C-末端分子區(qū)域有關(guān),但目前尚不清楚這一作用是否與NgR有關(guān),Nogo-B可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上促凋亡基因Bel-x1、Bcl-2作用,誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)張力改變和Ca2+內(nèi)流,影響腫

8、瘤生長。 對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,特別是膠質(zhì)瘤,目前只有Nogo-A方面的研究內(nèi)容。Nogo-A的胞外功能域Nogo-66和髓鞘相關(guān)糖蛋白(Myelin-aSsociated glyCcprotein,MAG)可以讓人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG的黏附性和遷移能力顯著下降。他認(rèn)為Nogo-66和MAG可以通過NgR激活,調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤生長和遷移,這個現(xiàn)象具有潛在的臨床治療應(yīng)用價值。但是目前尚沒有Nogo-B和膠質(zhì)瘤的報道。更多的是VEGF、

9、PDGF等常見血管增殖相關(guān)生長因子方面的研究。我們知道VEGF是一種與血管增殖相關(guān)生長因子,又稱血管通透性因子。其主要生物學(xué)活性有：1、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。2、增加血管的通透性、維持毛細(xì)血管周圍內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。3、改變細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)血管生長,促進(jìn)血管構(gòu)建。4、促進(jìn)血管形成前暫時性基質(zhì)沉積。5、選擇性激活小動脈、小靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖。6、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的趨化。7、保護(hù)新生血管。 已有文獻(xiàn)報道惡性腫瘤中腫瘤細(xì)胞

10、和血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF都有表達(dá),且隨著腫瘤惡性度的增加,VEGF的表達(dá)增加。VEGF主要分布于高度惡性的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中和血管內(nèi)皮細(xì)胞,定位于細(xì)胞漿,低惡性膠質(zhì)瘤表達(dá)相對較低,正常腦組織幾乎檢測不出。最新的研究表明腫瘤細(xì)胞表面也有VEGF受體高表達(dá),并且受VEGF信號通路的調(diào)節(jié),且很多腫瘤高表達(dá)VEGF,腫瘤細(xì)胞的生長和存活在部分程度上也受VEGF通路的調(diào)節(jié)。因此阻斷VEGF的信號傳導(dǎo)通路可以從多個方面抑制腫瘤的生長。目前已有報道采用VE

11、GF單克隆抗體、VEGF受體拮抗劑等抑制腫瘤生長,最近還有利用RNA干擾技術(shù),利用VEGF siRNA實行抗腫瘤血管生成療法的報道,取得了一定進(jìn)展。 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)某段序列同源的雙鏈RNA(dsRNA),可致該mRNA發(fā)生特異性降解從而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。因基因沉默現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平,又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)。目前,RNAi技術(shù)作為一個強

12、有力的遺傳學(xué)工具,提供了高效、特異性的抑制基因表達(dá)的手段,成為基因功能研究、抗病毒感染研究和基因治療研究的重要方法。 惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展離不開微血管內(nèi)皮細(xì)胞,微血管內(nèi)皮細(xì)胞同樣受到惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的各種細(xì)胞因子的作用。目前對這些因子中的Nogo-B蛋白的研究主要集中于周圍血管的內(nèi)皮細(xì)胞上,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,Nogo-B對膠質(zhì)瘤細(xì)胞和膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞到底起了什么樣的作用,Nogo-B和VEGF之間到底存在什么樣的關(guān)系,V

13、EGF是否參與了Nogo-B的調(diào)節(jié)通路,如何利用Nogo-B和VEGF實行抗腫瘤血管生成療法,這些是本課題的研究內(nèi)容和目的。 研究分四個部分,第一部分：人膠質(zhì)瘤組織中Nogo-B的功能表達(dá)。第二部分：人膠質(zhì)瘤源性微血管內(nèi)皮細(xì)胞中Nogo-B的功能表達(dá)。第三部分:VEGF參與膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞Nogo-B表達(dá)的調(diào)控機制。第四部分：干擾Nogo-B表達(dá)抑制微血管內(nèi)皮增生。 研究采用以下研究方法：1、免疫組織化學(xué)、Weste

14、rn blotting法、Real-time PCR法分析在不同級別的膠質(zhì)瘤組織中Nogo-B在蛋白和mRNA水平上的功能表達(dá)。2、利用免疫磁珠內(nèi)皮細(xì)胞分選系統(tǒng)純化膠質(zhì)瘤源性微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Glioma derivedmicrovascular endothelial cells,GDMECs)。3、利用免疫組織化學(xué)法、Western blotting法、Real-time PCR法分析Nogo-B在不同級別的GDMECs中的功能表達(dá)。

15、4、將VEGFsiRNA瞬時轉(zhuǎn)染至GDMECs中,采用ELISA法、Real-time PCR法分析VEGF對GDMECs中Nogo-B表達(dá)的功能調(diào)控。5、采用小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞系bEnd.3,將Nogo-B siRNA和bEnd.3共培養(yǎng),觀察bend.3增殖情況,探討以Nogo-B作為靶點實行抗膠質(zhì)瘤血管生成療法的可行性。 本研究得到如下結(jié)果：1、人膠質(zhì)瘤組織中Nogo-B與正常腦組織相比,染色陽性率降低。2、在高級別的膠質(zhì)

16、瘤中Nogo-B在蛋白和mRNA水平上表達(dá)下調(diào),Nogo-B表達(dá)水平隨著腫瘤惡性程度增加而顯著降低。3、在GDMECs中,Nogo-B蛋白、mRNA表達(dá)強度隨著其來源膠質(zhì)瘤的惡性程度增加而顯著增加。4、瞬時轉(zhuǎn)染VEGFsiRNA到GDMECs后,Real-time PCR、ELISA結(jié)果表明干擾VEGF表達(dá)能顯著促進(jìn)降低Nogo-B的蛋白表達(dá)。5、Nogo-B siRNA和bEnd.3細(xì)胞共孵育后,bEnd.3中Nogo-B表達(dá)顯著抑制

17、,其抑制程度具有siRNA劑量依賴性：抑制Nogo-B表達(dá)后,和對照組相比,bEnd.3增殖受到抑制。 本研究得出結(jié)論：1、在人膠質(zhì)瘤組織中,Nogo-B在蛋白和mRNA水平的表達(dá)與腫瘤惡性度成負(fù)相關(guān)。2、在GDMECs中,Nogo-B在蛋白和mRNA水平與其來源的膠質(zhì)瘤惡性度成正相關(guān)。3、Nogo-B在GDMECs和膠質(zhì)瘤腫瘤組織中存在雙向表達(dá)。4、Nogo-B在膠質(zhì)瘤中低表達(dá),其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡能力下降,參與了膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)