血管內(nèi)皮細(xì)胞對膠質(zhì)瘤侵襲性生長的影響及其與Notch信號通路關(guān)系.pdf

1、研究背景和目的:
　　膠質(zhì)瘤是最常見而又最難治愈的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，占成人顱內(nèi)腫瘤的50％，手術(shù)治療難度大，術(shù)后復(fù)發(fā)率高[1-2]。過去幾十年間，盡管手術(shù)方法不斷改進(jìn)及放療、化療、免疫療法、基因療法等多種輔助療法的綜合應(yīng)用，臨床療效取得一定進(jìn)展，但其總體預(yù)后改善欠佳。膠質(zhì)瘤無論分化高低均具有浸潤性生長、富血管化、無包膜形成的生物學(xué)特性[3]。一般認(rèn)為膠質(zhì)瘤的高侵襲性、富血管化及腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用影響正是膠質(zhì)瘤難根

2、治、易復(fù)發(fā)的根本原因[4]。有研究表明，膠質(zhì)瘤的侵襲性生長與其所處的微環(huán)境密切相關(guān)[5-6]。血管內(nèi)皮細(xì)胞與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的相互作用可促進(jìn)膠質(zhì)瘤的侵襲生長[8]，但其具體機(jī)制不明。Notch信號通路在中樞系統(tǒng)發(fā)育及新生血管生成過程中均發(fā)揮關(guān)鍵作用，Notch信號的激活與血管新生和膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖關(guān)系密切[9]。由此我們提出假設(shè)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)膠質(zhì)瘤的侵襲遷移過程中，Notch信號通路可能起著重要的調(diào)控作用。我們擬通過觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞對膠質(zhì)

3、瘤細(xì)胞侵襲力的影響及Notch信號通路相關(guān)因子在其中的相應(yīng)變化情況來探討血管內(nèi)皮細(xì)胞對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長作用的相關(guān)機(jī)制。
　　研究內(nèi)容和方法:
　　1、在體外建立人腦膠質(zhì)瘤母細(xì)胞U87及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)共培養(yǎng)模型:將U87及HUVEC細(xì)胞均置于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37℃、5％ CO2、濕度95％的恒溫培養(yǎng)箱孵育。按實驗要求將細(xì)胞分組，分別為單獨培養(yǎng)U87細(xì)胞培養(yǎng)組，U87細(xì)胞與血管內(nèi)皮

4、細(xì)胞正常共培養(yǎng)組和DAPT阻斷血管內(nèi)皮細(xì)胞Notch信號通路與U87細(xì)胞共培養(yǎng)組。
　　2、觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞對膠質(zhì)瘤侵襲性生長的影響。在體外利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87進(jìn)行共培養(yǎng)，采用體外快速侵襲力測定法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲力在不同狀態(tài)的血管內(nèi)皮細(xì)胞作用下的變化。
　　3、Real-Time PCR檢測不同培養(yǎng)狀態(tài)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞Cathepsins B、MMP-9、MMP-2、Notc

5、h-1、Notch-2、Hes-1、D114基因表達(dá)。在體外利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，使用熒光定量PCR檢測共培養(yǎng)組的U87細(xì)胞的Notch基因及相關(guān)侵襲因子的表達(dá)與單獨培養(yǎng)條件下比較的變化情況;
　　4、觀察不同培養(yǎng)狀態(tài)下膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外血管擬態(tài)現(xiàn)象
　　結(jié)果:
　　1、發(fā)現(xiàn)與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)時，可致膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87侵襲力增加，而當(dāng)阻斷血管內(nèi)皮細(xì)胞Notch信號通

6、路后，可降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲力增加幅度。穿膜數(shù)量分別為單獨培養(yǎng)組40.0±3.92個，正常共培養(yǎng)組平均81.5±2.89個，DAPT抑制組為61.8±4.72個(P＜0.05)。
　　2、RT-PCR結(jié)果顯示，與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的CathepsinsB、MMP-9、Notch-1、Notch-2、Hes-1、Dll4基因mRNA表達(dá)上調(diào)，阻斷血管內(nèi)皮細(xì)胞的Notch信號通路后，Cathepsins B、MMP-9、

7、Notch-1、Notch-2、Hes-1基因的上調(diào)幅度受限（P均＜0.05），但DLL4無明顯改變，而各組間MMP-2基因的表達(dá)無明顯異同，不具有統(tǒng)計意義。其中Notch1 mRNA的2-ΔΔCT分別為1、6.87、1.82; Notch2 mRNA的2-ΔΔCT分別為1、22.78、14.52; Hes1 mRNA的2-ΔΔCT分別為1、3.89、3.20; MMP-9 mRNA的2-ΔΔCT分別為1、16.45、2.33;Cath

8、epsins B mRNA的2-ΔΔCT分別為1、29.24、13.00; DLL4 mRNA的2-ΔΔCT分別為1、9.38;
　　3、在膠質(zhì)瘤體外血管擬態(tài)中，膠質(zhì)瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后，正常共培養(yǎng)組U87細(xì)胞可見細(xì)胞變?yōu)闂l索狀且相互融合.連接成網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)。在對照組中，U87細(xì)胞單獨培養(yǎng)12h后仍生長紊亂.無明顯規(guī)律.但是在DAPT抑制共培養(yǎng)組中，U87細(xì)胞開始變形，有部分細(xì)胞出現(xiàn)互相連接，形成網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，但遠(yuǎn)較正常共培養(yǎng)