NRG-1基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)心肌細(xì)胞的影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得南昌大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。學(xué)位論文作c掏：刪撕卜陽(yáng)／日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解南昌大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)

2、位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)南昌大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同時(shí)授權(quán)中國(guó)科學(xué)技術(shù)信息研究所將本學(xué)位論文收錄到《中國(guó)學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)》，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)向社會(huì)公眾提供信息服務(wù)。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書(shū))學(xué)位論文作者簽名(手寫(xiě))：智P移彳簽字日期：盈‘，，／年易月，／日簽川Fh雌沙

3、導(dǎo)瓤日字簽摘要lUlIIIIFIIIIIIIIIIIIlY1958047摘要目的：神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1在抗心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖上以及心衰的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用。由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞在血管內(nèi)皮修復(fù)和新生血管形成發(fā)揮重要作用，并且在心臟重構(gòu)上發(fā)揮潛在的作用。本研究重點(diǎn)探討神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(NRG1)基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)后的條件培養(yǎng)液以及未轉(zhuǎn)染rl：1NRG1的EPCs條件培養(yǎng)液對(duì)心肌細(xì)胞凋亡、增殖及相關(guān)細(xì)胞因子

4、的影響。方法：(1)分離擴(kuò)增培養(yǎng)及鑒定大鼠EPCs，應(yīng)用PCR技術(shù)體外合成NRG一1對(duì)應(yīng)的基因組片段，定向克隆到pGCFUGFP慢病毒載體，構(gòu)建大鼠NRG1真核表達(dá)載體。將pGCFUGFPrhNRG1慢病毒載體轉(zhuǎn)染入第二代的EPCs。分別于轉(zhuǎn)染后第2、4、6天后，應(yīng)用熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，并于轉(zhuǎn)染后第6天應(yīng)用RTPCR及WesternBlot法檢測(cè)NRG1的mRNA及蛋白的表達(dá)。(2)分離培養(yǎng)及鑒定大鼠心肌細(xì)胞，用TNFalpha建

5、立心肌細(xì)胞凋亡模型。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)A和實(shí)驗(yàn)B兩部分。實(shí)驗(yàn)A：1、檢測(cè)NRG1基因轉(zhuǎn)染EPCs后的條件培養(yǎng)液以及未轉(zhuǎn)染NRG1的EPCs條件培養(yǎng)液對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)分三組，空白組：乳鼠心肌細(xì)胞TNFa(50ng／m1)；對(duì)照組：乳鼠心肌細(xì)胞TNFa(50ng／m1)EPCS培養(yǎng)液上清；實(shí)驗(yàn)組：乳鼠心肌細(xì)胞TNFa(50ng／m1)轉(zhuǎn)染NRG1后的EPCs培養(yǎng)液上清。24h后Hoechest33342。PI雙染色法及AnnexinFI

6、FC／PI流式細(xì)胞法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡率。2、檢測(cè)NRG1基因轉(zhuǎn)染EPCs后的條件培組，空白組：乳鼠心肌細(xì)胞。對(duì)照組：乳鼠心肌細(xì)胞EPCs培養(yǎng)養(yǎng)液以及未轉(zhuǎn)染NRG1的EPCs條件培養(yǎng)液對(duì)心肌細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)分三液上清。實(shí)驗(yàn)組：乳鼠心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染NRG1后的EPCs培養(yǎng)液上清。24h后應(yīng)用MTT法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞增殖率。實(shí)驗(yàn)B：檢測(cè)NRG1基因轉(zhuǎn)染EPCs后的條件培養(yǎng)液以及未轉(zhuǎn)染NRG1的EPCS條件培養(yǎng)液對(duì)心肌細(xì)胞細(xì)胞因子的影響。實(shí)