心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液的體外抗腫瘤作用及其機制研究.pdf

1、目的:
　　研究鼠心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液(myocardial cells culture medium，CMCM)的體外抑瘤作用及其分子機制，初步揭示可能參與的相關(guān)信號通路;并分析不同溫度和蛋白酶處理對CMCM活性的影響，初步探討其理化性質(zhì)，為后期分離提純抑瘤成分提供一定的理論依據(jù)和向?qū)В瑸樾募≡葱蕴烊豢鼓[瘤物質(zhì)應(yīng)用于鼻咽癌等腫瘤的治療提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.收集成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液、平滑肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液、骨

2、骼肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液、心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液。將上述條件培養(yǎng)液作用于人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞，CCK8法檢測作用48h后的細(xì)胞存活率的情況。計算細(xì)胞存活率，繪制柱狀圖。
　　2.用1∶1的心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液原液，1∶2稀釋的心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液，1∶4稀釋的心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液，1∶8稀釋的心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液及1∶16稀釋的心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液分別干預(yù)培養(yǎng)人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞12，24，36，48小時，以不具有抑瘤作用的成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液作

3、為陰性對照，采用CCK8法檢測細(xì)胞存活情況，計算細(xì)胞存活率，并繪制生長曲線。
　　3.以心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液干預(yù)培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞（鼠源性肺腺癌細(xì)胞Lewis，高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞L9981，人宮頸癌細(xì)胞Hela，人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2)及正常細(xì)胞（大鼠肝細(xì)胞BRL，鼠腎小球系膜細(xì)胞MCs）48小時后，采用CCK8法檢測細(xì)胞存活情況，計算細(xì)胞存活率。
　　4.采用6孔板及Transwell嵌套構(gòu)建心肌細(xì)胞與CNE-2細(xì)胞或鼠正常肝細(xì)

4、胞BRL的共培養(yǎng)模型，觀察CNE-2細(xì)胞或BRL細(xì)胞單獨培養(yǎng)或與心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)時的形態(tài)學(xué)特征。
　　5.以不具有抑瘤作用的成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液作為陰性對照，觀察不同溫度(4℃、25℃、50℃、100℃)處理心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液(CMCM)原液后，CMCM對CNE-2細(xì)胞生長的影響情況。計算細(xì)胞存活率，繪制柱狀圖。
　　6.以不具有抑瘤作用的成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液作為陰性對照，觀察不同蛋白水解酶（胰蛋白酶或鏈霉蛋白酶）處理心肌細(xì)

5、胞條件培養(yǎng)液(CMCM)原液后，CMCM對CNE-2細(xì)胞生長的影響情況。計算細(xì)胞存活率，繪制柱狀圖。
　　7.采用TUNEL試劑盒和DAPI染色劑檢測CMCM原液干預(yù)CNE-2細(xì)胞0，12，24，48小時后的細(xì)胞凋亡情況，計算各處理時間點的凋亡率，繪制柱狀圖。
　　8.根據(jù)前期基因芯片結(jié)果的提示，采用real-time PCR法檢測CMCM原液干預(yù)CNE-2細(xì)胞48小時后，CNE-2細(xì)胞內(nèi)8個凋亡相關(guān)基因(Caspase3、

6、BCL2L11、PERP、ENDOG、PPP3R1、THAP1、CCAR1、AATF)的mRNA的表達情況。
　　9.根據(jù)real-time PCR法的驗證結(jié)果，篩選出5個感興趣的凋亡相關(guān)基因(Caspase3、Bim、PERP、ENDOG，P53)，用Western blot法檢測其蛋白表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液和平滑肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液作用于CNE-2細(xì)胞48h后細(xì)胞存活率分別為105.56±7.

7、53％和116.00±7.00％，與陰性對照組比較無顯著差異（P＞0.05）;而骨骼肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液和心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液作用CNE-2細(xì)胞48h后細(xì)胞存活率則分別為35.90±9.20％和35.00±3.42％，陰性對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，兩者之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　2.12小時時，CMCM原液及1∶2稀釋的CMCM已表現(xiàn)出對CNE-2細(xì)胞的生長抑制作用(P＜0.05)，且濃度較高的CMCM組相

8、較濃度較低的1∶2稀釋組對CNE-2細(xì)胞的生長抑制率更大，但兩者之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.18)。24小時、36小時、48小時組的CMCM原液、1∶2稀釋組以及24小時的1∶4稀釋組均表現(xiàn)出對CNE-2細(xì)胞生長的明顯抑制(P＜0.05)，其內(nèi)部之間的差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，這種抑制作用隨藥物濃度的降低而減小，表現(xiàn)出一定的濃度依賴性;隨用藥時間的延長而增強，表現(xiàn)出一定的時間依賴性。由于較高比例稀釋后，CMCM已無明顯抑制細(xì)胞

9、生長作用(P＞0.05)，較高比例稀釋組未見明顯藥物作用的時間、濃度依賴關(guān)系。
　　3.心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液對腫瘤細(xì)胞Lewis、L9981、Hela、CNE-2的生長有不同程度的抑制作用，作用上述細(xì)胞48后的細(xì)胞存活率分別為64.69±15.86％，45.90±5.50％，42.97±6.45％，39.10±4.0％，與陰性對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，而對于正常細(xì)胞BRL、MCS的細(xì)胞存活率無顯著影響（P＞0.05）。

10、
　　4.共培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn):鼻咽癌CNE-2細(xì)胞或正常人肝細(xì)胞BRL單獨培養(yǎng)時，細(xì)胞緊貼6孔板底部，呈扁平、多邊、鋪路石樣外觀，細(xì)胞間緊密連接成片，細(xì)胞較大，胞質(zhì)豐富。與心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)后，正常肝細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，但鼻咽癌細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)透亮，胞核固縮，部分細(xì)胞變圓，變小，貼壁能力下降甚至脫壁，培養(yǎng)基中可見較多的脫壁細(xì)胞漂浮，6孔板底部細(xì)胞分散，數(shù)量降低，表現(xiàn)出類似凋亡的形態(tài)學(xué)變化。
　　5.CCK8法檢測發(fā)現(xiàn):不同溫度(

11、4℃、25℃、50℃、100℃)處理后的CMCM仍然具有對CNE-2細(xì)胞生長的抑制作用(P＜0.05)，各組存活率分別為45.05±6.18％，43.91±4.66％，49.39±5.39％，49.96±5.04％，各處理組之間對細(xì)胞存活率的影響無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　6.不同蛋白水解酶（胰蛋白酶或鏈霉蛋白酶）處理心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液(CMCM)原液后，CMCM對CNE-2細(xì)胞仍具有生長抑制作用，其抑制率與未處理的CMC

12、M組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　7.采用TUNEL試劑盒檢測CMCM原液干預(yù)CNE-2細(xì)胞不同時間后CNE-2細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示:未經(jīng)CMCM作用的CNE-2細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)極少，凋亡率僅:2.04±0.65％，而經(jīng)CMCM作用后的CNE-2細(xì)胞，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，且隨著作用時間的延長，凋亡率逐漸增加:CMCM作用CNE-2細(xì)胞12h后的凋亡率為:10.17±3.04％;24h后的凋亡率為:19.60±5.84％;4

13、8h后的凋亡率為:33.80±4.23％，各組與陰性組相比，差異均具統(tǒng)計學(xué)意義，呈現(xiàn)出時間依賴關(guān)系。
　　8.Real-time PCR在mRNA水平上驗證到了CMCM原液干預(yù)CNE-2細(xì)胞48小時后的6個表達上調(diào)的凋亡相關(guān)基因:Caspase3、Bim、PERP、ENDOG、PPP3R1、THAP1及1個表達下調(diào)的凋亡相關(guān)基因AATF，基因芯片驗證符合率為:87.5％。
　　9.根據(jù)Real-time PCR結(jié)果，West

14、ern blot法在蛋白水平上驗證了5個凋亡相關(guān)基因:Bim、Caspase3、P53、PERP、ENDOG的表達，結(jié)果顯示表達上調(diào)，與Real-time PCR的結(jié)果相符。
　　結(jié)論:
　　1.心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液可能成為一種安全有效的抗腫瘤藥物。
　　2.心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液中抑瘤活性物質(zhì)對熱、蛋白酶具有較好的穩(wěn)定性。
　　3.心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液的抑瘤機制與誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。
　　4.心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)凋亡