Survivin對心肌細胞的抗凋亡作用及其機制的研究.pdf

1、內(nèi)源性的硫化氫(H<,2>S)被譽為是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三種重要的氣體信號分子，它具有重要的生理意義，在心血管系統(tǒng)，它有舒張血管降低血壓、抑制血管平滑肌細胞增殖減輕血管重構(gòu)以及減小缺血再灌注時的心肌梗死面積等多種生物學(xué)效應(yīng)。但其對缺血缺氧引發(fā)的心肌細胞的凋亡是否有直接作用至今還未見報道。我們用原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞研究H<,2>S對心肌細胞的直接作用及其分子信號機制，發(fā)現(xiàn)生理濃度下的NaHS預(yù)處理心肌細胞能

2、夠抑制缺氧/復(fù)氧引發(fā)的心肌細胞凋亡，呈濃度依賴性，這是H2S抗心肌細胞凋亡的首次報道。NaHS預(yù)處理心肌細胞能夠增加Survivin和Bcl-2表達，抑制Caspase3前體斷裂。Survivin參與了NaHS對心肌細胞的保護作用，但是Survivin與Bcl-2和Caspase3的關(guān)系是怎樣是我們下一步要解決的問題。我們首次發(fā)現(xiàn)GSK3 β的活性在NaHS抗心肌細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，但是其作用機制如Survivin的表達是否受到GS

3、K3 β的活性的影響，GSK3β的上游調(diào)控分子是什么，GSK3β通路與MAPK通路間是否有串話等還有待進一步的研究。 心肌細胞上的內(nèi)阿片類受體的激活能夠發(fā)揮對心肌細胞的直接保護作用。阿片受體屬G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，分為μ、δ、κ三種亞型，大量的研究證實在心肌細胞上δ、κ兩種亞型的受體占據(jù)了主導(dǎo)地位，究竟是哪種內(nèi)阿片類受體參與了對心肌細胞的保護作用仍然是一個受爭議的問題。Survivin蛋白是存在于胚胎發(fā)育和腫瘤組織中的凋亡

4、調(diào)節(jié)蛋白，在終末分化的細胞中不存在，但最近有研究證實其在心肌細胞中也有表達，那么其是否有直接抗凋亡作用以及其是否參與內(nèi)阿片類受體的激活抗心肌細胞凋亡的作用及參與其中的信號通路是什么也是我們關(guān)注的重點。另外，Bcl-2，Bax 是介導(dǎo)線粒體凋亡途徑中的重要蛋白，它們是否參與了阿片受體激活對心肌細胞的保護作用還未可知。 本實驗以新生大鼠心肌細胞為研究對象，用無糖無血清培養(yǎng)的方法建立細胞凋亡的體外模型。用DNA電泳和TUNEL檢測斷裂

5、的DNA片段，用實時熒光定量PCR(realtime-PCR)和Western blot檢測凋亡蛋白和信號分子，用RNA干擾和基因過表達的方法研究survivin的作用。 結(jié)果表明，非選擇性的內(nèi)阿片類受體激動劑嗎啡預(yù)處理可以明顯降低無糖無血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡百分率，這種作用可以被非選擇性的內(nèi)阿片類受體拮抗劑納洛酮(Naloxone)和選擇性δ受體拮抗劑Natrindole所阻斷，不能被選擇性κ受體拮抗劑GNTI所阻斷，證實

6、了δ受體參與了對心肌細胞的保護作用，因此我們選擇特異性δ受體激動劑DADLE進行下面的實驗。發(fā)現(xiàn)DADLE能夠早期抑制心肌細胞凋亡時活性氧(ROS)的產(chǎn)生，阻止線粒體跨膜電位△Ψmt的下降，并且DADLE還能夠促使ERK信號分子出現(xiàn)發(fā)生時間較晚但維持時間較長的一種激活狀態(tài)，而且Bcl-2，基因的轉(zhuǎn)錄和表達也伴隨著ERK的激活而升高，DADLE同時也抑制了Bax蛋白從胞漿到線粒體的轉(zhuǎn)位，除此之外，我們首次發(fā)現(xiàn)DADLE還能夠促使Survi

7、vin基因的轉(zhuǎn)錄和表達，發(fā)揮了對心肌細胞的保護作用。ERK的阻斷劑PD98059和U0126在阻斷了Bcl-2和Survivin蛋白的表達和促進Bax蛋白從胞漿到線粒體的轉(zhuǎn)位的同時也抑制了PD98059抗心肌細胞凋亡的作用，由此我們首次證明ERK是心肌細胞中Survivin的上游調(diào)控激酶。用RNA干擾的方法下調(diào)細胞內(nèi)Survivin明顯阻斷DADLE的保護作用，證明Survivin直接介導(dǎo)了DADLE對心肌細胞的保護作用；過表達Surv

8、ivin蛋白的細胞能夠抵抗無糖無血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，證明Survivin基因的激活能夠直接發(fā)揮對心肌細胞的保護作用。 綜上所述，我們的研究首次發(fā)現(xiàn)Survivin對心肌細胞有直接的保護作用并且首次證實Survivin介導(dǎo)了DADLE對心肌細胞的保護作用，ERK 信號通路和 P13-K信號通路是Survivin的上游激活分子信號通路，并且DADLE還通過減少活性氧(ROS)的產(chǎn)生，阻止線粒體跨膜電位△Ψmt的下降，促進Bc