機械性創(chuàng)傷誘發(fā)小鼠心肌細胞凋亡機制的研究.pdf

1、研究背景：
　　機械性創(chuàng)傷（Mechanicaltrauma,MT,如車禍引起的創(chuàng)傷性傷害）在世界上是一個重要的醫(yī)療和社會問題。眾所周知，胸部MT可以直接引起心臟損傷（如心臟挫傷和血管撕裂）。然而，幾個臨床小組報道，即使沒有直接的機械性心血管損害，鈍性胸部MT也可以引起心肌梗死及心臟功能減退。這些結(jié)果強烈提示,MT除了即刻對心臟的直接損傷外，還可以引起一種繼發(fā)性心臟傷害，其機制尚不清楚。
　　越來越多的證據(jù)表明，心肌細胞的凋

2、亡可以導致心臟功能不全。MT后即刻給予非選擇性半胱天冬蛋白酶（Caspase）抑制劑，不僅可以阻斷MT引起的心肌細胞凋亡，而且可以減輕MT后的心臟功能不全。這些結(jié)果表明MT引起心肌細胞凋亡，繼之可引起MT后的心臟功能不全。然而，MT導致MT后心肌細胞凋亡的病理性介質(zhì)的來源和作用機制仍不清楚。辨明MT后心臟功能不全的發(fā)病機制，尋找阻止MT后繼發(fā)性心臟損害的治療策略，對于減少所有MT相關的器官損害至關重要。
　　研究目的：
　　

3、1、確定MT引起心肌細胞凋亡的病理性介質(zhì)的來源，源于創(chuàng)傷性心肌細胞（TCs）還是創(chuàng)傷性血漿（TP）；
　　2、找出MT引起心肌細胞凋亡的主要病理性介質(zhì)；
　　3、闡明MT通過病理性介質(zhì)觸發(fā)心肌細胞凋亡的細胞內(nèi)信號通路，以期搞清病理性介質(zhì)、細胞凋亡與氧化/硝化應激的關系。
　　研究方法：
　　1、制備小鼠非致命性機械性MT模型。麻醉小鼠后，將其置于Noble-Collip鼓（直徑12英寸），以40rpm的轉(zhuǎn)速，旋轉(zhuǎn)

4、200圈，造成小鼠非致命性MT傷害。
　　2、為了確定MT后引起心肌細胞凋亡的病理性介質(zhì)來源于TCs還是TP，分別分離MT組小鼠心肌細胞（TCs）和對照組小鼠心肌細胞（NCs），并分別用含有10％的TP(從MT后1.5h不同小鼠得到）或正常小鼠血漿（NP）的培養(yǎng)液培養(yǎng)12h。
　　3、為了辨明MT后觸發(fā)心肌細胞凋亡的病理性介質(zhì),分離MT小鼠心肌細胞，并分別與下列因子一起培養(yǎng)12h：1)NP;2)TP;3)干擾素(IFN-)、

5、白細胞介素1（IL-1）和腫瘤壞死因子α（TNF-）的混合物;4)分別填加細胞因子混合物中的單一成分；5)TP和抗TNF-抗體;6)TNF-基因敲除鼠的TP。
　　4、為了闡明氧化/硝化應激在MT觸發(fā)的心肌細胞凋亡中的作用，分離MT小鼠心肌細胞，分別給予下列之一處理并培養(yǎng)細胞12h：1)NP;2)TP;3)TP和1400W（一種高度選擇性iNOS抑制劑）;4)TP和apocynin（一種NADPH氧化酶抑制劑）;或5)TP和FP1

6、5（一種ONOO-分解催化劑）。
　　5、給予野生型小鼠MT處理后，在體分別給予溶劑、etanercept(一種TNF-拮抗劑)、1400W、apocynin和FP15;給予TNF-基因敲除（TNFα-/-）鼠MT處理，不做任何其他處理。將小鼠于MT12h后處死。
　　6、使用相應酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）分析試劑盒測定血漿IFN-、IL-1和TNF-濃度。
　　7、通過檢測caspase-3活性、ELISA法測定核

7、小體或末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的末端標記術(shù)（TUNEL）染色確定心肌細胞的凋亡情況。
　　8、使用光澤精加強發(fā)光法檢測心肌。O2-的產(chǎn)生量。
　　9、使用ELISA法檢測心肌細胞硝基酪氨酸（一種在體ONOO-印跡）的含量。
　　10、使用蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）法檢測心肌gp91phox（NADPH氧化酶的一種主要成分）和iNOS含量。
　　11、使用化學發(fā)光NO探測儀檢測NOX（NO及其代謝產(chǎn)物NO

8、2和NO3的統(tǒng)稱）含量。
　　研究結(jié)果：
　　1、將TP加到TCs培養(yǎng)液中，引起caspase-3活性的升高（NC+NP組的2.18±0.24倍,P<0.01,n=9）。而將TCs與NP一起培養(yǎng)，未觀察到caspase-3活性顯著性改變（NC+NP組的1.13±0.09倍,P>0.05,n=10）。然而，將TP加到NCs培養(yǎng)液中，觀察到caspase-3活性的升高（NC+NP組的1.88±0.18倍,P<0.01,n=9）。

9、這一結(jié)果證實，MT引起心肌細胞凋亡的病理性介質(zhì)存在于TP，而非TCs自身及NP中。
　　2、雖然MT后，血漿中不同的細胞因子表現(xiàn)出不同的時間曲線的變化，但與對照組比較，創(chuàng)傷動物IL-1、IFN-、和TNF-的血漿水平均顯著性升高（2.19±0.16vs.1.11±0.02pg/mg蛋白,1.22±0.14vs.0.68±0.02pg/mg蛋白,0.48±0.02vs.0.19±0.01pg/mg蛋白,P<0.01,n=7-9）。值

10、得注意的是，所有這三個細胞因子達到高峰的時間均早于文獻所述的MT后心肌細胞凋亡發(fā)生的時間點，即在或早于MT后1.5h。
　　3、將NP和細胞因子混合物與TCs一起培養(yǎng)，導致caspase-3活性的升高（NP組的1.71±0.18倍,P<0.01,n=9），升高程度與使用TP處理心肌細胞所觀察到的相似，提示這些細胞因子在TP引起的心肌細胞凋亡中發(fā)揮作用。
　　4、與NP組比較，單獨填加IFN-或IL-1，對caspase-3活

11、性無明顯影響（NP組的0.88±0.15和1.11±0.12倍,P>0.05,n=7-9）。然而，以細胞因子混合物中的使用濃度，單獨填加TNF-顯著性增加了caspase-3活性（NP組的1.64±0.14倍,P<0.01,n=9），提示TNF-是細胞因子混合物中引起心肌細胞凋亡的細胞因子。
　　5、使用抗TNF-抗體中和TNF-，幾乎完全阻斷了TP引起的心肌細胞caspase-3的激活(1.13±0.17vs.1.88±0.18

12、NP組的倍數(shù)，P<0.01,n=7)。與野生型小鼠TP比較，填加TNF--/-小鼠的TP不能引起顯著性caspase-3的激活（1.10±0.19vs.1.88±0.18NP組的倍數(shù)，P<0.01,n=9）。這些結(jié)果證明存在于TP中的TNF-是TP引起心肌細胞凋亡首要因素。
　　6、與NP組比較，使用TP處理心肌細胞，iNOS和gp91phox蛋白表達顯著性上調(diào)(NP組的2.44±0.42倍和NP組的1.63±0.18倍，P<0.

13、01,n=7-9)，NO和。O2-產(chǎn)生顯著性增多(NP組的2.37±0.31倍和NP組的1.54±0.17倍，P<0.01,n=7-9)，ONOO-的產(chǎn)生也顯著性增加(8.02±1.23vs.1.87±0.25nmol/g蛋白,P<0.01,n=7-9)。
　　更重要的是，使用抗TNF-抗體中和TNF-幾乎完全阻斷了TP引起的氧化/硝化應激，與溶劑組相比，iNOS和gp91phox蛋白的顯著性表達被抑制(1.34±0.32vs.2

14、.44±0.42NP組的倍數(shù),1.15±0.10vs.1.63±0.18NP組的倍數(shù)，P<0.01,n=7-9)，NO和。O2-產(chǎn)生明顯減少(1.32±0.12vs.2.37±0.30NP組的倍數(shù),1.11±0.09vs.1.54±0.17NP組的倍數(shù)，P<0.01,n=7-9)，ONOO-的產(chǎn)生也顯著性減少(2.77±0.72vs.8.02±1.23nmol/g蛋白，P<0.01,n=7-9)。這些結(jié)果提供了明確的證據(jù)，即存在于TP中

15、的TNF-是引起TCs顯著氧化/硝化應激的首要因素。
　　7、與TP組比較，使用1400W顯著性減少了置于TP的心肌細胞的NO產(chǎn)生量（1.04±0.13vs2.26±0.11NP組的倍數(shù),P<0.01,n=10），而未影響。O2-的產(chǎn)生量（1.42±0.07vs.1.62±0.15NP組的倍數(shù),P>0.05,n=10）。相反，使用apocynin顯著性減少了。O2-的產(chǎn)生量（1.04±0.05vs.1.62±0.15NP組的倍數(shù),

16、P<0.01,n=10），而未影響NO的產(chǎn)生量（2.20±0.19vs.2.26±0.11NP組的倍數(shù),P>0.05,n=10）。使用FP15既未影響NO（2.16±0.18vs.2.26±0.11NP組的倍數(shù),P>0.05,n=9），也未影響。O2-的產(chǎn)生量（1.40±0.06vs.1.62±0.15NP組的倍數(shù),P>0.05,n=9）。然而，所有三種處理均顯著性減少了ONOO-的產(chǎn)生量（2.61±0.35,3.06±0.55,1.5

17、5±0.33vs.8.09±1.28nmol/g蛋白,P<0.01,n=11），并且減少了TP引起的caspase-3激活（1.24±0.16,1.05±0.10,1.01±0.14vs.1.91±0.14NP組的倍數(shù),P<0.01,n=10）。這些結(jié)果表明TNF-觸發(fā)的氧化/硝基化應激在TP引起的心肌細胞凋亡中發(fā)揮著極重要的作用。
　　8、在體實驗，與對照組比較，MT導致野生型小鼠顯著性心肌細胞凋亡，表現(xiàn)為TUNEL陽性細胞增多

18、（8.37±0.57vs.0.32±0.09％，P<0.01,n=10）和caspase-3活性升高（是對照組2.9±0.2倍，P<0.01,n=10）。使用etanercept明顯減少了MT后心肌細胞TUNEL陽性染色率（1.2±0.14％vs.8.37±0.57％,P<0.01，n=10）和降低caspase-3活性（1.5±0.45vs.2.9±0.2對照組的倍數(shù),P<0.01,n=10）。給人留下深刻印象的是，與野生型MT小鼠比

19、較，在TNF-α基因敲除MT小鼠，幾乎無TUNEL陽性細胞（0.8±0.19％vs.8.37±0.57％,P<0.01,n=10）和caspase-3激活（1.4±0.16vs.2.9±0.2對照組的倍數(shù)，P<0.01,n=10）。
　　9、與對照組比較，野生型小鼠MT處理后，iNOS(29,610±5,093vs.1,938±717AU,P<0.01，n=10)和gp91phox(104,317±4,361vs.10,619±1

20、,522AU,P<0.01，n=10)的蛋白表達上調(diào)，NO(9.9±0.7vs.7.1±0.4μmol/g蛋白,P<0.01，n=10)和。O2-（273±13.9vs.153±8.3RLU/mg組織,P<0.01,n=10）產(chǎn)生增加，并且蛋白質(zhì)硝基化明顯增加（2.86±0.09vs.1.67±0.05nmol/g蛋白,P<0.01,n=10）。
　　然而，與溶劑組比較，在體使用etanercept或TNF-基因敲除處理，降低iN

21、OS蛋白表達（3,380±1,053，2,512±1,154vs.29,610±5,093AU,P<0.01,n=10）和NO的產(chǎn)生量（7.04±0.56，7.44±0.32vs.9.9±0.7μmol/g蛋白,P<0.01,n=10），減少gp91phox蛋白表達（26,478±4,361,6861±2,239vs.104,317±4,361AU,P<0.01,n=10）和。O2-的產(chǎn)生（163.1±12.70,146.1±22.18

22、vs.273.2±14.93RLU/mg組織,P<0.01,n=10），并且減少了蛋白質(zhì)硝基化（2.09±0.12,1.54±0.19vs.2.86±0.08nmol/g蛋白,P<0.01,n=10）。
　　10、在體實驗，與溶劑組比較，使用1400W/apocynin阻斷iNOS/NADPH氧化酶的活性，或使用FP15增加ONOO-的分解，明顯地減少了TUNEL染色數(shù)（2.50±0.49、1.51±0.28和1.62±0.12％