人VEGF165基因轉(zhuǎn)染人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：隨著人口老齡化和飲食結(jié)構(gòu)改變,下肢缺血性疾病已成為老年人的常見病和多發(fā)病 ,是截肢致殘的主要原因，已成為血管外科研究的一個(gè)難點(diǎn)和熱點(diǎn)。促進(jìn)組織血管新生研究已發(fā)展成為一種治療缺血性疾病的新方法。治療性血管新生可通過三種方法得以實(shí)現(xiàn)：生長因子蛋白治療，細(xì)胞移植以及基因轉(zhuǎn)染。血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮生長因子在血管形成和促血管新生的過程中起著重要作用，本研究擬將基因治療和干細(xì)胞治療方法相結(jié)合，探討人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子165(hVEGF1

2、65)基因轉(zhuǎn)染人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）及對EPCs增殖和分泌VEGF和NO能力的影響。
　　 方法：取經(jīng)過rhG-CSF動員的健康成人的外周血，采用密度梯度離心法提取單個(gè)核細(xì)胞，接種在hFN包被的培養(yǎng)板上，M199培養(yǎng)液（含F(xiàn)BS和VEGF）培養(yǎng)，培養(yǎng)至第7d，對貼壁細(xì)胞進(jìn)行EPCs的鑒定：⑴倒置顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞形態(tài)；⑵激光共聚焦顯微鏡觀察經(jīng)DiI-acLDL和FITC-UEA-I雙染色的貼壁細(xì)胞；然后對pcDNA3.

3、1-hVEGF165質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，抽提，并利用雙酶切法及測序進(jìn)行鑒定，實(shí)驗(yàn)分為三組：脂質(zhì)體介導(dǎo)pcDNA3.1-hVEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白對照組。通過ELISA法和硝酸還原酶法分別測定各組上清液中VEGF和一氧化氮（NO）的含量；噻唑藍(lán)（MTT）檢測hVEGF165基因修飾對EPCs增殖的影響。
　　 結(jié)果：FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL雙染色陽性細(xì)胞為正在分化的EPCs,發(fā)黃色熒