慢病毒介導(dǎo)VEGF165基因修飾的嗅鞘細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)在世界范圍內(nèi)均被認(rèn)為是主要的公共健康問題，常導(dǎo)致患者嚴(yán)重的神經(jīng)功能損害。SCI后，由于炎癥反應(yīng)，空洞形成，髓磷脂相關(guān)抑制劑以及膠質(zhì)瘢痕的形成均造成軸突再生困難，而且脊髓的內(nèi)源性前體細(xì)胞分化為成熟的膠質(zhì)細(xì)胞能力有效。因此，使用外源細(xì)胞移植治療SCI，成為目前研究的熱點(diǎn)之一。
　　 嗅鞘細(xì)胞(Olfactory Ensheathing cells，OECs)，以及嗅神經(jīng)成纖維細(xì)

2、胞，共同構(gòu)成嗅神經(jīng)的包被部分。OECs伴隨嗅神經(jīng)纖維從鼻腔嗅粘膜直至嗅球神經(jīng)層。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，OECs移植治療有助于SCI后軸突的更新和功能學(xué)恢復(fù)。而且，OECs也可以作為基因的載體治療SCI。
　　 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)，最早發(fā)現(xiàn)于1983年，當(dāng)初被命名為腫瘤分泌的血管滲透因子，后在1989年得到純化，并命名為VEGF。VEGF是一種分泌性絲裂原

3、，可與其酪氨酸激酶受體結(jié)合，具有促進(jìn)血管生成的作用。研究表明，VEGF同樣可以促進(jìn)神經(jīng)形成，有助于對神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)，刺激軸突生長以及抑制凋亡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，使用VEGF蛋白或者外源性VEGF基因轉(zhuǎn)染，均可以促進(jìn)軸突更新，減輕二次損傷以及促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。
　　 目前嗅鞘細(xì)胞與VEGF聯(lián)合治療脊髓損傷未見報(bào)導(dǎo)。本研究中，我們使用表達(dá)VEGF基因的嗅鞘細(xì)胞治療脊髓損傷。該研究將是治療脊髓損傷一次非常有價(jià)值的嘗試。

4、　　 第一部分 OECs的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 目的:體外分離、培養(yǎng)，鑒定OECs。
　　 方法:采用差速貼壁法和免疫抑制劑法，從乳鼠嗅球中獲得OECs。觀察其一般形態(tài)，并行免疫熒光鑒定。
　　 結(jié)果:光鏡觀察見細(xì)胞具備典型的OECs形態(tài)學(xué)特征。免疫熒光結(jié)果顯示:OECs陽性表達(dá)GFAP，p75NFGR，細(xì)胞純度大于90％。
　　 結(jié)論:分離培養(yǎng)出OECs，形態(tài)學(xué)和免疫表型符合OECs標(biāo)準(zhǔn)
　　

5、 第二部分慢病毒載體pLVX-IRES-Neo-VEGF165的構(gòu)建及包裝，分泌VEGF的OECs建立。
　　 目的:構(gòu)建表達(dá)VEGF的慢病毒載體，并進(jìn)行包裝、鑒定、純化及滴度測定。觀察慢病毒感染OECs的效率，檢測目的基因的表達(dá)。
　　 方法:通過PCR獲得VEGF165基因，酶切后鑒定。再通過雙酶切后的連接反應(yīng)，構(gòu)建出慢病毒載體pLVX-IRES-Neo-VEGF165。pLVX-IRES-Neo-VEGF165轉(zhuǎn)

6、染HEK293細(xì)胞。病毒液用氯化銫法進(jìn)行純化，倍比稀釋法測病毒滴度。使用不同感染復(fù)數(shù)(MOI)感染OECs，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。RT-PCR檢測VEGF基因表達(dá)。VEGF相對表達(dá)水平比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間的多重比較采用LSD檢驗(yàn)。western bolt法檢測VEGF蛋白表達(dá)。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±SD）表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0軟件，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　

7、　 結(jié)果:測序證明，慢病毒載體pLVX-IRES-Neo-VEGF165成功構(gòu)建，倍比稀釋法檢測病毒滴度達(dá)到108 pfu/mL。RT-PCR和western bolt法證實(shí)OECs-VEGF表達(dá)VEGF基因和蛋白。
　　 結(jié)論:利用PCR方法成功獲取了目的基因VEGF165。成功構(gòu)建了重組慢病毒表達(dá)載體pLVX-IRES-Neo-VEGF165，并在HEK293細(xì)胞完成包裝。感染后的OECs可表達(dá)VEGF基因和蛋白。

8、　　 第三部分慢病毒介導(dǎo)VEGF165基因修飾的嗅鞘細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷
　　 目的:以慢病毒介導(dǎo)的VEGF165基因修飾的嗅鞘細(xì)胞移植治療大鼠脊髓半橫斷損傷，觀察其療效。
　　 方法:構(gòu)建大鼠脊髓半橫斷損傷模型。動(dòng)物隨機(jī)分為:PBS移植組，OECs移植組，OECs-VEGF移植組。
　　 損傷7天后，分別將PBS，OECs以及OECs-VEGF移植于脊髓損傷處。細(xì)胞組在移植前，行Hoechst33342標(biāo)

9、記。在SCI前及損傷后24h、1w、2w、3w、4w、5w、6w進(jìn)行BBB評分評價(jià)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況。移植后7天，酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immuno sorbent assay ELISA)法檢測各組體內(nèi)VEGF蛋白表達(dá)。移植后5w，免疫熒光法檢測移植細(xì)胞在體內(nèi)的存活、5-HT神經(jīng)纖維數(shù)量，HE染色方法檢測脊髓空洞體積，westerbolt法檢測體內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。
　　 體內(nèi)VEGF蛋白水平，5-HT神

10、經(jīng)纖維數(shù)量，脊髓空洞體積檢測結(jié)果比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間多重比較采用LSD法。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的BBB評分比較，采用重復(fù)測量方差分析(repeat measureANOVA)，組間多重比較采用LSD法。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±SD）。用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:SCI后1周以內(nèi)，各組BBB評分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，第2周至第6周，OECs

11、-VEGF組與PBS組相比，BBB評分出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);第3周至第6周，OECs組與PBS組比較，BBB評分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);第3周至第6周，OECs組和OECs-VEGF組相比，BBB評分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。細(xì)胞移植后1周脊髓組織中VEGF含量，PBS組:5.34±1.66pg/mg，OECs組:11.36±1.46 pg/mg，OECs-VEGF組:108.87±22.33 pg/mg。三組間均存

12、在顯著差異(P＜0.001)。LSD法行組問比較發(fā)現(xiàn)，OECs-VEGF組VEGF蛋白水平顯著高于另兩組的VEGF蛋白水平。5-HT神經(jīng)纖維數(shù)量，PBS組:8.71±0.35％; OECs組:17.43±0.66％; OECs-VEGF組:28.50±0.63％;F組問=275.474; P=0.0001三組間均存在顯著差異(P＜0.05)。LSD法行組間比較發(fā)現(xiàn)，OECs-VEGF組VEGF蛋白水平顯著高于另兩組的VEGF蛋白水平(P

13、＜0.05)。HE染色檢測脊髓空洞體積，PBS組:18.18±0.39; OECs組:13.98±0.66; OECs-VEGF組:9.41±0.61;F組問=224.454; P=0.0001三組間均存在顯著差異(P＜0.05)。LSD法行組間比較發(fā)現(xiàn)，OECs-VEGF組脊髓空洞體積百分比顯著低于另兩組的脊髓空洞體積百分比(P＜0.05)。Western blot檢測了凋亡相關(guān)蛋白，OECs-VEGF組與PBS組，OECs組相比，c