慢病毒介導(dǎo)人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞移植治療大鼠腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的：中風(fēng)是一類嚴(yán)重影響人類健康的疾病，尤其是缺血性腦血管病(ischemiccerebrovasculardisease，ICD)，造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)大量神經(jīng)細(xì)胞缺失及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)受損，導(dǎo)致患者長(zhǎng)期神經(jīng)功能障礙。目前治療缺血性中風(fēng)的方法，臨床上療效比較確切的，只有超早期血管內(nèi)治療的方法，通過恢復(fù)腦血流來挽救缺血區(qū)瀕臨死亡的細(xì)胞。由于中風(fēng)發(fā)生后神經(jīng)細(xì)胞死亡進(jìn)展迅速，大腦的再生能力相當(dāng)有限，使得中風(fēng)及相關(guān)問題的處理相當(dāng)困難?；蛑委熀?/p>

2、干細(xì)胞移植，是近年來有關(guān)中風(fēng)治療研究的兩個(gè)主要途徑，旨在防止或減少缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡的發(fā)生，以及刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)增殖，或直接發(fā)揮“細(xì)胞替代”作用，為ICD的治療帶來一線希望。 然而，中風(fēng)發(fā)生后，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)腦組織修復(fù)的促進(jìn)作用非常有限。有研究表明，大約80％新增殖的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞會(huì)在6周內(nèi)死亡，僅有0.2％的細(xì)胞缺失能得以替代。干細(xì)胞移植(包括神經(jīng)干細(xì)胞胞、骨髓

3、間充質(zhì)干細(xì)胞等)后，一定程度上能改善腦缺血?jiǎng)游锏纳窠?jīng)功能，但是，其機(jī)理不十分明確。到現(xiàn)在止，多數(shù)研究者認(rèn)為，干細(xì)胞移植是通過所謂的“bystandermechanism”而非直接“細(xì)胞替代”而發(fā)揮治療作用。近年來，干細(xì)胞治療腦血管病的研究的重點(diǎn)已轉(zhuǎn)向刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖并防止其凋亡的方向上來。特別是神經(jīng)干細(xì)胞已經(jīng)被用作基因治療的載體，可將治療基因攜帶到病灶，通過治療基因在缺血性損傷局部表達(dá)，來改變神經(jīng)干細(xì)胞巢所處的微環(huán)

4、境，即通過對(duì)所謂“bystandermechanism”機(jī)制的放大作用，來對(duì)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化及存活進(jìn)行調(diào)控，有望為中風(fēng)的治療帶來新的希望。 本課題研究目的是探討人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(humanneurotrophin-3，hNT-3)基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞移植后，對(duì)缺血性腦損傷大鼠海馬齒狀回(dentategyrus，DG)和紋狀體半暗帶內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖與分化的影響，以及對(duì)神經(jīng)功能改善的治療作用，探討其可能的治療機(jī)

5、制，為腦缺血的干細(xì)胞治療尋找新途徑。 方法： 實(shí)驗(yàn)共分三部分。第一部分：從孕14天Sprague-Dawley(S-D)大鼠胚胎的腦組織分離出神經(jīng)干細(xì)胞，采用無血清培養(yǎng)法，進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，并通過免疫熒光化學(xué)染色(巢蛋白)進(jìn)行鑒定。取傳至第5～6代神經(jīng)干細(xì)胞，以1×105個(gè)細(xì)胞/500μl/孔接種于24孔板，分別按復(fù)感染指數(shù)(Multiplicitiesofinfection，MOIs值)為0、1、5、10、15、20

6、加入攜帶報(bào)告基因GFP的慢病毒載體(lentiviralvector-GFP，LV/GFP)稀釋液，每一滴度加六孔，共六組。2～3天后于倒置熒光顯微鏡下觀察各組GFP的表達(dá)效率，并在3天后進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞球進(jìn)行計(jì)數(shù)，觀察LV/GFP對(duì)NSCs增殖的影響。并行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，得出各組NSCs的GFP陽性轉(zhuǎn)染率。第二部分：重組表達(dá)hNT-3基因的載體質(zhì)粒(pGC-E1/hNT3)，并與2種輔助質(zhì)粒(pHelper1.0和pHelper2.0)

7、在包裝細(xì)胞293T內(nèi)應(yīng)用Lipofectamine重組，構(gòu)建成表達(dá)hNT3的慢病毒載體(lentiviralvector-hNT3，LV/hNT3)。并通過RT-PCR和Western-blot檢測(cè)病毒載體的生物學(xué)活性。第三部分：雄性S-D大鼠建立腦缺血再灌注腦損傷模型，并隨機(jī)分為三組。實(shí)驗(yàn)組用LV/hNT3轉(zhuǎn)染5～6代NSCs，并在術(shù)后第七天，將NSCs-hNT3移植到大鼠紋狀體半暗帶。對(duì)照組移植普通NSCs或生理鹽水。各組大鼠在細(xì)胞

8、移植前后的不同時(shí)期進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能和行為學(xué)檢測(cè)評(píng)分，并取樣檢測(cè)細(xì)胞移植點(diǎn)NT-3及其受體TRKC的表達(dá)水平。應(yīng)用免疫熒光染色方法對(duì)細(xì)胞移植2周后內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖與分化進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果 第一部分：NSCs以懸浮細(xì)胞球方式生長(zhǎng)，nestin染色陽性。轉(zhuǎn)染GFP基因后，除MOI值為0的對(duì)照組外，2～3天后各孔均有GFP表達(dá)。MOI值從0增至10，細(xì)胞的陽性表達(dá)率逐漸提高(P＜0.05)，MOI值為10的組能獲得＞90％的轉(zhuǎn)

9、染率。但MOI值從10增至20，形成的神經(jīng)干細(xì)胞球數(shù)目卻逐漸減少(P＜0.05)。第二部分：細(xì)胞轉(zhuǎn)染hNT-3基因2～3天后，細(xì)胞提取物RT-PCR檢測(cè)陽性，陽性克隆基因測(cè)序比對(duì)證實(shí)載體構(gòu)建正確，Western-blot檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)病毒載體轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染細(xì)胞后具有生物學(xué)活性。第三部分：與對(duì)照組比較，hNT-3基因修飾的NSCs移植后能在缺血區(qū)遷移，在移植點(diǎn)能分泌較高水平的hNT-3蛋白(P＜0.001)，并且TRKC基因表達(dá)水平增加(P＜0

10、.01)。移植hNT-3基因修飾的NSCs，能增加缺血性腦損傷大鼠海馬齒狀回和紋狀體半暗帶的內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞增殖(BrdU+)和向神經(jīng)元方向分化(DCX+)(P＜0.05)，并能促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能(NSS評(píng)分)的改善(P＜0.05)。 結(jié)論： (1)LV是將外源基因轉(zhuǎn)入神經(jīng)干細(xì)胞的理想載體。以MOI為10的滴度，LV可將外源基因高效轉(zhuǎn)入神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)。(2)慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3基因的神經(jīng)干細(xì)胞移植后，能在缺血腦組織