NT-3基因修飾雪旺細胞和NT-3受體基因修飾神經干細胞聯合移植治療大鼠全橫斷脊髓損傷的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本研究旨在探討應用NT-3基因修飾雪旺細胞和NT-3受體基因修飾神經干細胞聯合移植治療大鼠全橫斷脊髓損傷,觀察這種治療策略能否更好地促進受損傷脊髓結構和功能的恢復,并分析其中可能的作用機制,為臨床治療急性脊髓損傷提供新策略及其實驗依據。本研究共分為以下四個部分: 第一部分人神經營養(yǎng)素.3基因重組腺病毒載體的構建、表達和生物活性檢測 目的:構建具有生物活性的人神經營養(yǎng)素-3(neurotrophin-3,NT-3)基因重組

2、腺病毒表達載體。 方法:從人腦組織mRNA中擴增NT-3基因全長cDNA,定向克隆于穿梭質粒pShuttle中,獲得一個帶有CMV啟動子的表達盒。再與腺病毒骨架DNA(Adeno-X viral DNA)體外連接,形成重組腺病毒質粒(pAd-NT-3)。用pAd-NT-3轉染人胚腎293細胞后包裝成有感染能力的重組腺病毒顆粒(Ad-NT-3)。 結果:NT-3基因RT-PCR擴增產物大小約801bp。Ad-NT-3 PC

3、R鑒定為正確重組子。RT-PCR、免疫細胞化學、EUSA及Wlestem blot檢測顯示Ad-NT-3能夠在其轉染的293細胞表達和分泌NT-3。這種NT-3能使體外培養(yǎng)的神經干細胞更多地分化為神經元樣細胞。 結論:應用體外連接法成功構建了人NT-3基因重組腺病毒表達載體,其表達產物具有促進神經干細胞分化為神經元樣細胞活性作用。 第二部分NT-3受體TrkC基因重組腺病毒載體的構建、表達及生物學活性檢測 目的:

4、構建人NT-3受體TrkC基因重組的腺病毒表達載體(Ad-TrkC),并探討Ad-TrkC介導的TrkC基因在神經干細胞內的表達及其對神經干細胞的生物活性作用。 方法:從人腦組織mRNA中擴增TrkC基因全長cDNA,定向克隆于穿梭質粒pShuttle中,獲得一個帶有CMV啟動子的表達盒。再將表達盒與腺病毒骨架DNA(Ad-X viral DNA)體外連接,形成重組腺病毒質粒(pAd-TrkC)。用pAd-TrkC轉染人胚腎29

5、3細胞后包裝成有感染能力的重組腺病毒顆粒(Ad-TrkC)。用RT-PCR檢測Ad-TrkC感染的神經干細胞的TrkC mRNA含量。用免疫細胞化學和Western blot檢測Ad-TrkC感染的神經干細胞TrkC受體蛋白水平。在體外培養(yǎng)條件下,觀察人NT-3對感染了Ad-TrkC的神經干細胞分化為神經元樣細胞和星形膠質樣細胞的影響。 結果:TrkC基因RT-PCR擴增產物為2478bp。Ad-TrkC經PCR鑒定為正確重組子

6、。在Ad-TrkC感染的神經干細胞中檢測到TrkC mRNA和TrkC受體蛋白,且表達產物和其配體NT-3結合后能使體外培養(yǎng)的神經干細胞更多地分化為神經元樣細胞,分化率達到55.2%,均高于其它對照組。 結論:應用體外連接法構建了人TrkC重組腺病毒表達載體,Ad-TrkC能在神經干細胞內表達TrkC受體蛋白,這種TrkC受體蛋白具有促進神經干細胞分化為神經元樣細胞活性的作用,這為進一步應用NT-3和TrkC聯合進行基因治療中樞

7、神經損傷研究奠定了基礎。 第三部分NT-3基因修飾雪旺細胞和nkC基因修飾神經干細胞體外聯合培養(yǎng)促進神經干細胞分化為具有形成突觸潛能的神經元樣細胞 目的:探討NT-3基因修飾雪旺細胞(SCs)和TrkC基因修飾神經干細胞(NSCs)體外聯合培養(yǎng)對神經干細胞分化為具有形成突觸潛能的神經元樣細胞的影響。 方法:應用各種MOI的Ad-GFP感染SCs和NSCs 24h后流式細胞儀(FCM) 檢測SCs和NSCs

8、的感染率,確定最適感染劑量。ELISA法定量檢測Ad-NT-3感染SCs 24h后上清中NT-3的含量。X-gal酶組織化學染色檢測Ad-LacZ感染的NSCs的β-半乳糖苷酶的表達。將含NT-3基因的重組腺病毒(Ad-NT-3)感染SCs(NT-3-SCs),同時將含TrkC基因的重組腺病毒(Ad-TrkC)感染NSCs(TrkC-NSCs),然后兩者聯合在體外共培養(yǎng)。實驗共分6組:NT-3-SCs+TrkC-NSCs組、NT-3-S

9、Cs+NSCs組、SCs+NSCs組、NSCs組、LacZ-SCs+LacZ-NSCs組和TrkC-NSCs組。培養(yǎng)4d后做nestin、MAP2、GFAP免疫組化,觀察NSCs的分化并計算其中神經元樣細胞(MAP2陽性)和星形膠質細胞樣細胞(GFAP陽性)的分化率以及保持未分化狀態(tài)(nestin陽性)的比率,并用PSD95和svnapsin免疫組化方法觀察并計算其中具有形成突觸潛能的神經元樣細胞的比率。 結果:1.SCs的最適

10、感染劑量為10 MOI,NSCs為80 MOI。2.ELISA法顯示NT-3-SCs培養(yǎng)液中NT-3的含量明顯高于未基因修飾的SCs。3.Ad-LacZ感染的NSCs呈β-半乳糖苷酶陽性。4.NSCs在體外可分化為神經元樣細胞和神經膠質樣細胞,與其它實驗組相比,NT-3-SCs+TrkC-NSCs組能更有效地提高神經元樣細胞的分化率,其中具有形成突觸潛能的神經元樣細胞的比率最高。而LacZ-SCs+LacZ-NSCs組與SCs+NSCs

11、組、NT-3-SCs+NSCs組與TrkC-NSCs組之間沒有明顯差別。 結論:NT-3基因修飾雪旺細胞和TrkC基因修飾神經干細胞體外聯合培養(yǎng)能夠促進神經干細胞向具有形成突觸潛能的神經元樣細胞分化。 第四部分NT-3基因修飾雪旺細胞和TrkC基因修飾神經干細胞聯合移植促進全橫斷脊髓損傷修復的研究 目的:探討NT-3基因修飾SCs和TrkC基因修飾NSCs聯合移植能否促進全橫斷脊髓損傷修復的研究。 方法:

12、用NT-3基因的重組腺病毒(Ad-NT-3)感染培養(yǎng)的SCs(NT-3-SCs).同時用含TrkC基因的重組腺病毒(Ad-TrkC)感染培養(yǎng)的NSCs(TrkC-NSCs)。此外,還將Ad-LacZ分別感染SCs和NSCs。然后建立大鼠全橫斷脊髓損傷模型,將NSCs、LacZ-SCs+LacZ-NSCs、NT-3-SCs+NSCs和NT-3-SCs+TrkC-NSCs分別移植到損傷處。所有動物存活60d后,進行爬網格測驗和BBB評分。接

13、著在脊髓橫斷處遠端3mm組織內注射熒光金(FG),動物再存活7d。在處死動物前檢測皮質運動誘發(fā)電位(CMEP)和皮質體感誘發(fā)電位(CSEP)。最后灌注固定動物,取材和切片并行形態(tài)學觀察。 結果:1.行為學檢測顯示,各細胞移植組與對照組相比,能促進大鼠后肢運動功能的恢復,其中恢復最好的是NT-3-SCs+TrkC-NSCs組。2.電生理檢測顯不NT-3-SCs+TrkC-NSCs組CSEP、CMEP的峰值明顯增大。3.NSCs能在

14、損傷脊髓內分化為神經元樣細胞和神經膠質樣細胞。NT-3-SCs和TrkC-NSCs聯合移植能提高NSCs在損傷脊髓內向神經元樣細胞的分化率,NT-3-SCs+TrkC-NSCs組的MAP2陽性細胞的比率為24.63%,高于其它處理組。4.各細胞移植組在脊髓橫斷處及附近有GAP-43、PSD95和synapsin陽性神經元樣細胞,以及5-HT、D β H和ChAT陽性神經纖維。5.在移植組中,脊髓橫斷處頭側端、中腦紅核及大腦體感運動區(qū)皮質

15、內錐體細胞層有少量FG標記神經元。6.與其它組相比,NT-3-SCs+TrkC-NSCs組L<,1>脊髓背核、中腦紅核及大腦體感運動區(qū)皮質內錐體細胞層存活的神經元數增多。7.基因修飾細胞移植到受損傷脊髓2個月后仍能表達外源基因產物(NT-3、TrkC和LacZ)。8.NT-3.SCs和TrkC-NSCs聯合移植能提高LN的表達,降低CSPGs的表達。9.電鏡下可見細胞移植組的脊髓損傷區(qū)內有再生的有髓鞘神經纖維和突觸樣結構。 結論

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