hTERT基因修飾雪旺細胞移植對脊髓損傷大鼠損傷區(qū)神經(jīng)修復(fù)相關(guān)蛋白表達的影響.pdf

1、目的：以逆轉(zhuǎn)錄病毒PLXSN為載體，將hTERT基因轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的大鼠雪旺細胞，檢測雪旺細胞端粒酶活性及細胞生物學(xué)特性的影響。進一步探討hTERT基因修飾雪旺細胞移植對脊髓損傷大鼠損傷區(qū)神經(jīng)修復(fù)相關(guān)相關(guān)白表達的檢測及對神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。
　　方法：體外培養(yǎng)大鼠雪旺細胞，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒PLXSN為載體介導(dǎo)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因轉(zhuǎn)染雪旺細胞，體外培養(yǎng) Wistar大鼠雪旺細胞，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒PLXSN為載體介導(dǎo)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶

2、(hTERT)基因轉(zhuǎn)染，分為3組：對照組、陰性轉(zhuǎn)染組、hTERT轉(zhuǎn)染組。用RT-PCR，Western blot檢測雪旺細胞在轉(zhuǎn)染前后hTERT基因和蛋白的表達。應(yīng)用細胞生長曲線、MTT比色法觀察細胞生長的優(yōu)化作用；采用流式細胞術(shù)測定細胞周期分布的變化。成年雌性Wistar大鼠71只，造模成功66只,隨機分為對照組，SCs組，hTERT-SCs組,22只/組，按照改良的Allen打擊法建立大鼠急性脊髓損傷模型。分別于造模前、造模后1天、

3、3天、1周、2周、3周、4周通過BBB評分、斜板試驗、改良的Tarlov評分進行運動功能評定。造模后72 h通過RT—PCR、Western blot檢測脊髓損傷區(qū)周圍AQP4/9、MMP9/2基因轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達，TUNEL法檢測細胞凋亡情況。造模后4周，HE染色及熒光顯微鏡觀測PKH-26標記的SCs存活及分布情況，通過免疫組化法檢測GFAP、Nogo及NF200的表達量，行HRP示蹤觀察神經(jīng)纖維再生情況，通過SEP和MEP觀察大鼠

4、神經(jīng)電生理恢復(fù)情況。
　　結(jié)果：通過逆轉(zhuǎn)錄病毒PLXSN介導(dǎo)的hTERT基因轉(zhuǎn)染大鼠雪旺細胞后，轉(zhuǎn)染hTERT后，hTERT轉(zhuǎn)染組與對照組、陰性轉(zhuǎn)染組相比hTERT基因和蛋白水平均有表達，細胞的生長速度明顯增快，細胞周期 G0/G1期減少，S期細胞數(shù)增多。各組間有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。RT-PCR，Western blot檢測顯示轉(zhuǎn)染hTERT基因的大鼠雪旺細胞體外能表達hTERT；大鼠下肢運動功能評價hTERT-SCs組優(yōu)

5、于SCs組，SCs組優(yōu)于對照組。造模后72小時 hTERT-SCs組細胞凋亡指數(shù)均明顯低于對照組（p<0.05）.造模后72小時，與對照組相比 hTERT-SCs組AQP4/9基因和蛋白表達均較顯著降低(p＜0.05）。造模后4周，HE染色對照組可見脊髓組織缺失及脊髓空洞形成，無神經(jīng)軸索通過。SCs組損傷區(qū)可見少量神經(jīng)軸索樣結(jié)構(gòu)，脊髓空洞較小，hTERT-SCs組可見較多神經(jīng)軸索樣結(jié)構(gòu)，未見脊髓空洞。PKH-26標記的陽性細胞數(shù)：hTE

6、RT-SCs組最多，SCs組次之，對照組最少，且各組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。造模后4周，hTERT-SCs組膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）、神經(jīng)絲蛋白（NF-200）的表達較對照組明顯升高，差異有顯著性意義（p<0.05），hTERT-SCs組Nogo蛋白的表達較對照組明顯降低，差異有顯著性意義（p<0.05），HRP陽性神經(jīng)纖維數(shù)：hTERT-SCs組最多，SCs組次之，對照組最少，各組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05

7、）。SEP和MEP的潛伏期：hTERT-SCs組SCs組>對照組，且各組之間差異有顯著性意義(p<0.05)。
　　結(jié)論：通過轉(zhuǎn)錄病毒PLXSN為載體介導(dǎo)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因轉(zhuǎn)染使雪旺細胞端粒酶活性明顯升高，能夠促進體外培養(yǎng)的大鼠雪旺細胞增殖。hTERT基因修飾雪旺細胞移植可促進脊髓損傷大鼠神經(jīng)突觸的再生，降低脊髓損傷區(qū)周圍 A