慢病毒載體介導(dǎo)HIF-1α基因修飾骨髓間質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)HIF-1α進(jìn)行定點(diǎn)突變獲得常氧下穩(wěn)定表達(dá)的HIF-1α突變體，構(gòu)建攜帶HIF-1α基因的重組慢病毒，為下一步感染靶細(xì)胞并在體內(nèi)外獲得長(zhǎng)期、穩(wěn)定的表達(dá)打下基礎(chǔ)；探討HIF-1α修飾骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響及其可能的作用機(jī)制。 方法：以pCDNA3.1-HIF-1α—P402A作為模板對(duì)HIF-1α的564、803位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得pCDNA3.1-HIF-1α—P402A—P5

2、64G—N803A質(zhì)粒，經(jīng)KpnⅠ和BamHⅠ酶切下目的基因HIF-1α—P402A—P564G—N803A片段，回收純化并克隆至pEGFP—N2獲得pHIF-1α—P402A—P564G—N803A—EGFP。將HIF-1-P402A—P564G—N803A—EGFP片段定向克隆至pENTR/D—TOPO中，構(gòu)建成Gateway入門載體pENTR—HIF-1α—P402A—P564G—N803A—EGFP。應(yīng)用Gateway LR重組

3、反應(yīng)將Gateway入門載體中目的基因轉(zhuǎn)入Gateway終載體pLenti6/V5-DEST中，構(gòu)建成突變型HIF-1α慢病毒載體pLenti6/V5-HIF-1α—P402A—P564G—N803A—EGFP。將慢病毒載體與慢病毒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，收獲并純化病毒液；利用第一部分成功收獲并純化的病毒液感染BMSCs，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HIF-1α的BMSCs后，通過RT—PCR和western blot的方法檢測(cè)HIF-1α在常氧

4、下的表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)HIF-1α下游靶基因EPO，VEGF和CXCR4在mRNA水平的表達(dá)。大鼠在成功制作大腦中動(dòng)脈阻塞模型后隨機(jī)分為三組：BMSCs—mHIF-1α移植組，BMSCs—EGFP移植組和PBS對(duì)照組。在缺血后3h經(jīng)股靜脈進(jìn)行體內(nèi)移植。在細(xì)胞移植后的1，7，14，28天進(jìn)行神經(jīng)功能檢查。TTC染色觀察缺血體積。通過TUNEL分析缺血側(cè)腦組織的細(xì)胞凋亡數(shù)目。使用pax6、DCX抗體免疫熒光雙標(biāo)的方法檢測(cè)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞并定

5、量分析pax6/DCX雙陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目以觀察內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞在各實(shí)驗(yàn)組的增殖、存活情況。 結(jié)果：經(jīng)過各個(gè)步驟的鑒定，成功構(gòu)建了攜帶HIF-1α基因的重組慢病毒，病毒滴度為3.36×108 TU/ml；常氧狀態(tài)下，BMSCs—mHIF-1α與BMSCs—EGFP相比，HIF-1α在mRNA及蛋白水平上的表達(dá)均上調(diào)，其下游基因EPO，VEGF和CXCR4 mRNA水平上的表達(dá)也明顯增加。細(xì)胞移植后的14天和28天，BMSCs—mHI

6、F-1α移植組較BMSCs—EGFP移植組和PBS對(duì)照組神經(jīng)功能恢復(fù)明顯改善。腦缺血后3天，BMSCs—mHIF-1α移植組腦梗死灶體積較BMSCs—EGFP移植組和PBS對(duì)照組明顯減少。在細(xì)胞移植后7天，兩細(xì)胞移植組的凋亡細(xì)胞數(shù)量在缺血側(cè)大腦半球皮質(zhì)區(qū)沒有明顯差異；而在海馬區(qū)，BMSCs—mHIF-1α移植組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯少于與BMSCs—EGFP移植組(P<0.05)；在細(xì)胞移植后14天，BMSCs—mHIF-1α移植組凋亡細(xì)胞數(shù)

7、量在海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)均少于BMSCs—EGFP移植組(P<0.05)。細(xì)胞移植后7天，BMSCs—mHIF-1α移植組在海馬區(qū)域觀察到pax6/DCX細(xì)胞數(shù)量明顯多于BMSCs—EGFP移植組和PBS對(duì)照組(P<0.05)。 結(jié)論：①通過定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)HIF-1α基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得常氧狀態(tài)下穩(wěn)定表達(dá)的突變型HIF-1α；HIF-1α表達(dá)上調(diào)誘導(dǎo)其下游靶基因的表達(dá)。②慢病毒介導(dǎo)HIF-1α基因修飾骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植能顯著改善腦缺