慢病毒載體介導(dǎo)HIF-1α基因修飾骨髓間質(zhì)干細(xì)胞對PC12細(xì)胞缺氧損傷影響的研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種來源于骨髓的非造血干細(xì)胞。研究證實(shí)BMSCs在體外培養(yǎng)的條件下，能分泌血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)及其他具有神經(jīng)營養(yǎng)活性的細(xì)胞因子，經(jīng)靜脈或動脈移植的BMSCs能夠通過血腦屏障到達(dá)缺血損傷區(qū)，通過細(xì)胞替代或分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子參與缺血腦損傷神經(jīng)功能的修

2、復(fù)。同時(shí)體外培養(yǎng)的BMSCs具有多向分化潛能、取材方便、體外培養(yǎng)擴(kuò)增容易、遺傳背景穩(wěn)定、有內(nèi)在組織相容性，免去了應(yīng)用其它干細(xì)胞時(shí)篩除異抗原的必要，可自體移植，消除了異體移植的復(fù)雜性和免疫原性，并能遷移，都顯示了其在基因治療中可能成為理想的基因治療運(yùn)載細(xì)胞。因此，BMSCs不僅本身可參與缺血腦損傷神經(jīng)功能的修復(fù)，同時(shí)還可作為腦缺血基因治療的載體。
　　 缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible factor-1，HIF

3、-1)是一種氧敏感的轉(zhuǎn)錄激活因子，在低氧誘導(dǎo)下哺乳動物的各種組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)。HIF-1是由α和β亞基一個(gè)組成的異源二聚體。α亞基為HIF-1所特有亞基，既是HIF-1的調(diào)節(jié)亞基又是活性亞基，β亞基又稱為芳香烴受體核移位體(ARNT)，在細(xì)胞內(nèi)呈構(gòu)成性表達(dá)，是HIF-1的構(gòu)成亞基。HIF-1的生物活性主要決定于HIF-1α亞基的活性和表達(dá)。腦缺血缺氧后，缺血灶組織血流量減少，葡萄糖和氧供應(yīng)不足，同時(shí)機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)釋放的一些物質(zhì)如胰島素樣

4、生長因子-1等因素誘導(dǎo)HIF-1在腦缺血灶組織中表達(dá)增加。HIF-1作為低氧反應(yīng)的一種核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過對其下游靶基因(VEGF、EPO、CXCR4等)的誘導(dǎo)表達(dá)，調(diào)控?zé)o氧代謝、血管生成、細(xì)胞增殖遷移分化等，在腦缺血損傷后的神經(jīng)功能修復(fù)中起重要的作用。
　　 本課題組前期實(shí)驗(yàn)將慢病毒載體介導(dǎo)突變型HIF-1α基因修飾BMSCs移植治療大鼠腦缺血模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦缺血區(qū)域神經(jīng)元存活數(shù)有所增加，同時(shí)神經(jīng)功能恢復(fù)程度較損傷對照組有較大

5、改善。但其具體機(jī)制不甚明了。本實(shí)驗(yàn)擬以神經(jīng)元樣細(xì)胞PC12細(xì)胞為體外缺血缺氧細(xì)胞模型，在缺氧條件下，將慢病毒載體介導(dǎo)突變型HIF-1α基因修飾的BMSCs(HIF-1α-BMSCs)與其進(jìn)行培養(yǎng)，探討HIF-1α-BMSCs對PC12細(xì)胞缺氧損傷的作用及其機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 通過慢病毒介導(dǎo)突變型HIF-1α轉(zhuǎn)染BMSCs，使BMSCs在常氧狀態(tài)下穩(wěn)定表達(dá)HIF-1α。并探討突變型HIF-1α修飾的大鼠骨髓間充

6、質(zhì)干細(xì)胞(HIF-1α-BMSCs)對神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞缺氧損傷的作用及其可能機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、利用本實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建的突變型HIF-1α慢病毒載體pLenti6/V5-HIF-1α-P402A-P564G-N803A-EGFP(簡稱pLenti6/V5-mHIF-1α-EGFP)與慢病毒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，收獲并純化病毒液。選擇合適的MOI的滴度感染BMSCs，并通過Blasticidin

7、篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HIF-1α基因的BMSCs(HIF-1α-BMSCs)。通過RT-PCR檢測HIF-1α、VEGF在HIF-1α-BMSCs中mRNA水平的表達(dá)，Western blot檢測常氧狀態(tài)下HIF-1α在HIF-1α-BMSCs中蛋白水平的表達(dá)。
　　 2、以神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞為細(xì)胞缺氧模型，模擬體內(nèi)建立體外缺血缺氧模型。實(shí)驗(yàn)共分為4組，分別為正常對照組、PC12缺氧組、PC12缺氧與BMSCs共培養(yǎng)組、PC12缺

8、氧與HIF-1α-BMSCs共培養(yǎng)組。利用HE染色觀察PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組PC12細(xì)胞凋亡狀況，RT-PCR檢測PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)基因survivin、caspase-3、bax、be1-2的mRNA表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光檢測survivin、caspase-3蛋白表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、流式細(xì)胞儀檢測MOI=100重組慢病毒感染BMSCs的效率約為79％～91％(48h)；RT-PCR結(jié)

9、果顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HIF-1α后，在BMSCs中HIF-1αVEGF的mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)；Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HIF-1α基因的BMSCs在常氧下可穩(wěn)定表達(dá)HIF-1α蛋白。
　　 2、MTT實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)顯示：PC12細(xì)胞缺氧0h，3h，6h，12h和24h的細(xì)胞活性分別為100％、90.3％、76.7％、45.1％、和23.3％，具有時(shí)間依賴性(圖2-1)。缺血缺氧12h后，細(xì)胞活性下降至50％以下，確定12h

10、為細(xì)胞模型缺血缺氧時(shí)間。
　　 3、PC12細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)學(xué)：缺氧12 h后，PC12細(xì)胞胞體腫脹混亂，胞內(nèi)變性顆粒增多，形態(tài)改變明顯；相當(dāng)部分細(xì)胞已碎裂死亡。與BMSCs和HIF-1α-BMSCs共培養(yǎng)組，PC12胞體腫脹較輕，細(xì)胞死亡數(shù)較少，HIF-1α-MSC組保護(hù)作用更為明顯。
　　 4、PC12細(xì)胞凋亡率：與缺氧組相比，BMSCs和HIF-1α-BMSCs都能明顯降低缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡率，且HIF-1α-

11、BMSCs作用更為明顯。正常對照組、缺氧PC12細(xì)胞組、缺氧PC12細(xì)胞+BMSCs組及缺氧PC12細(xì)胞+HIF-1α-BMSCs組PC12細(xì)胞凋亡率分別為5.1±2.4％、53.8±3.3％、39.7±4.1％、26.6±1.9％。
　　 5、凋亡相關(guān)基因檢測：與正常組相比，缺氧組PC12細(xì)胞survivin mRNA表達(dá)未見明顯改變(P＞0.05)，蛋白表達(dá)略有上調(diào)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，caspase-3的mRN

12、A和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(p＜0.05)，bax/bcl-2 mRNA表達(dá)比值明顯增加(p＜0.05)。與缺氧組相比，BMSCs及HIF-1α-BMSCs能上調(diào)PC12細(xì)胞survivin的表達(dá)(p＜0.05)，下調(diào)caspase-3的表達(dá)(p＜0.05)，bax/bcl-2 mRNA表達(dá)比值降低(p＜0.05)，且HIF-1α-BMSCs作用更為明顯(p＜0.01)。
　　 本文結(jié)論：
　　 1.慢病毒載體介導(dǎo)突變型HIF

13、-1α基因修飾的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在常氧狀態(tài)下能穩(wěn)定表達(dá)HIF-1α，且使其下游基因VEGF表達(dá)上調(diào)。
　　 2.慢病毒載體介導(dǎo)HIF-1α基因修飾的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞能降低PC12細(xì)胞缺氧損傷引起的凋亡率。
　　 3、HIF-1α-BMSCs降低PC12細(xì)胞缺氧損傷引起的凋亡其機(jī)制可能是：BMSCs轉(zhuǎn)染HIF-1α后，HIF-1α表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)其下游靶基因VEGF表達(dá)，并通過旁分泌作用于PC12細(xì)胞，使其抗凋亡基因surv