脊髓鞘內(nèi)注射慢病毒介導(dǎo)前強(qiáng)啡肽基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨癌痛大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng).pdf

1、研究目的：
　　1、強(qiáng)啡肽鎮(zhèn)痛效應(yīng)強(qiáng)、安全性好、無(wú)呼吸抑制和成癮性等優(yōu)勢(shì)，是目前生物鎮(zhèn)痛研究的重點(diǎn)。探討慢病毒介導(dǎo)的大鼠前強(qiáng)啡肽(PDYN)基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)中的表達(dá)，為后續(xù)研究大鼠癌痛模型的生物鎮(zhèn)痛提供條件。
　　2、探討脊髓鞘內(nèi)注射前強(qiáng)啡肽基因（PDYN）修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)治療骨癌痛大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。
　　研究方法：
　　1、采用貼壁篩選法分離和擴(kuò)增BM-MSCs，流式

2、細(xì)胞學(xué)和體外成脂、成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)鑒定。構(gòu)建大鼠PDYN慢病毒載體并感染BM-MSCs，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)和 Western blot法篩選最適感染復(fù)數(shù)(MOI)；實(shí)驗(yàn)分為空白組(BM-MSCs)、實(shí)驗(yàn)組（PCDH-CMV-PDYN-EF1-copGFP）、空載體(PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP)，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)和Western blot檢測(cè)PDYN表達(dá)變化，采

3、用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)強(qiáng)啡肽(DYN)蛋白表達(dá)。
　　2、將含5×106/ml MADB-106大鼠乳腺癌細(xì)胞注射到SD大鼠脛骨靠近干骺端骨髓腔，制作骨癌痛模型（B組），同時(shí)設(shè)對(duì)照組（C組，n=8）。所有大鼠于術(shù)前1天、術(shù)后3、5、7、10、14天測(cè)定熱刺激縮足潛伏期（paw withdrawal thermal latency,PWL）、自由行走痛評(píng)分、機(jī)械刺激縮足閾值（paw withdrawal mechanical th

4、reshold,PWT）疼痛行為學(xué)指標(biāo)。骨癌痛模型制備成功的B組（n=24）采用隨機(jī)數(shù)字法均分為3組，分別鞘內(nèi)注射無(wú)菌生理鹽水20μl(B1組)、鞘內(nèi)注射BMSCs-VESTOR細(xì)胞懸液20μl(B2組)、注射BMSCs-PDYN細(xì)胞懸液20μl(B3組)。鞘內(nèi)注射后3、5、7、10、14天檢測(cè)疼痛行為學(xué)指標(biāo)，最后一次行為學(xué)檢測(cè)后處死大鼠并取L4-6節(jié)段脊髓組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)測(cè)定PDYN mRNA 

5、表達(dá)，Western Blot和石蠟切片免疫組化測(cè)定脊髓背角強(qiáng)啡肽(DYN)蛋白表達(dá)。另采用裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)該細(xì)胞系的安全性。
　　研究結(jié)果：
　　1、BM-MSCs呈長(zhǎng)梭形纖維細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng)，多數(shù)表達(dá)CD29、CD44、CD90，少數(shù)表達(dá)CD45。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后油紅O染色為陽(yáng)性；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)，經(jīng)茜素紅染色呈橘紅色。流式細(xì)胞儀檢測(cè)示BM-MSCs細(xì)胞中CD29、CD90、CD44、CD45陽(yáng)性率分別為（99.8

6、0±0.19）％、（99.62±0.24）%、（96.86±1.27）%、（0.82±0.06）%，轉(zhuǎn)染PDYN基因后BM-MSCs表面標(biāo)記CD29、CD90、CD44、CD45陽(yáng)性率分別為（99.59±0.34）%、（98.06±1.51）%、（95.23±0.71）%、（10.23±0.59）%。轉(zhuǎn)染前后BM-MSCs干細(xì)胞特性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。經(jīng)PCR擴(kuò)增克隆測(cè)序鑒定慢病毒載體PCDH-CMV-PDYN-EF1-c

7、opGFP構(gòu)建成功，重組慢病毒滴度為5×106IU/mL。綠色熒光蛋白的表達(dá)和Western blot結(jié)果示慢病毒MOI=100為最佳病毒感染復(fù)數(shù)。qPCR、Western blot檢測(cè)到經(jīng)慢病毒載體感染后的BM-MSCs中PDYN基因表達(dá)均上調(diào)（P<0.05），免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)顯示DYN蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)。
　　2、與C組和術(shù)前基礎(chǔ)值相比，B組大鼠在造模術(shù)后5天PWL逐漸縮短（P<0.05），PWT顯著降低(P<0.05)，自

8、由行走痛評(píng)分逐漸升高（P<0.05），術(shù)后14天差異尤為明顯（P<0.05）；B組間經(jīng)鞘內(nèi)注射處理后，B3組PWL逐漸延長(zhǎng)（P<0.05），自由行走痛評(píng)分降低（P<0.05），PWT逐漸升高(P<0.05)，而B(niǎo)1組和B2組在鞘內(nèi)注射前后無(wú)顯著變化(P>0.05)。B組大鼠脊髓組織的PDYN mRNA表達(dá)均高于C組(P<0.05)，且B3組較B1組、B2組PDYN mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。Western Blot和石蠟切片

9、免疫組化結(jié)果顯示B組與C組比較DYN蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05)，B3組較B1組、B2組DYN蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05)，B1組和B2組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)表明注入BMSCs-PDYN細(xì)胞系未發(fā)現(xiàn)致瘤性。
　　研究結(jié)論：
　　1、成功培養(yǎng)BM-MSCs和構(gòu)建大鼠PDYN基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體，在BM-MSCs中能高效穩(wěn)定表達(dá)PDYN基因和分泌DYN蛋白。
　　2、鞘內(nèi)注射前強(qiáng)啡肽基因修