脂質(zhì)體介導(dǎo)IGF-1基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨缺損是一種常見(jiàn)的損傷，由于軟骨的自我修復(fù)能力極弱，一旦受損將導(dǎo)致壞死，發(fā)生骨性關(guān)節(jié)炎。胰島素樣生長(zhǎng)因-1(IGF-1)是在軟骨發(fā)育和軟骨自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中最重要的生長(zhǎng)因子之一，IGF-1能刺激軟骨細(xì)胞分裂增殖，并促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成Ⅱ型膠原和蛋白聚糖來(lái)維持軟骨細(xì)胞表型，故其可能作為軟骨缺損治療的有效藥物。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有以下特點(diǎn)：①易于獲取，來(lái)源穩(wěn)定，可來(lái)源于自體和異體成人骨髓穿刺，從成人的脂肪和滑膜中也可獲?。虎趥鞔芰?/p>

2、強(qiáng)，表型穩(wěn)定；③多向分化，在體內(nèi)不同微環(huán)境和不同誘導(dǎo)因子的作用下可分化成為軟骨、骨骼、神經(jīng)、肌腱和肌肉組織等。近來(lái)在諸多領(lǐng)域，尤其是作為組織工程的種子細(xì)胞受到重視，若將轉(zhuǎn)基因技術(shù)與干細(xì)胞技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建新型種子細(xì)胞無(wú)疑非常具有意義。 材料和方法: 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 日本大耳白兔4只，雌雄不限，月齡1個(gè)月，體重0.5-1.0kg，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 二、實(shí)驗(yàn)方法 (1)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分

3、離培養(yǎng)及生物學(xué)活性觀察 ①兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)用密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合，分離、純化兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增。 ②流式細(xì)胞儀檢測(cè)取P<,1>代細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析、鑒定。 ③生物學(xué)性狀的觀察用倒置顯微鏡每日觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況并拍照。繪制P<,1>、P<,3>、P<,5>代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 (2)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1及綠色熒光蛋白雙載體的構(gòu)建 ①質(zhì)粒pcDNA3.1-IG

4、F-1的擴(kuò)增及純化。 ②pcDNA3.1-IGF-1質(zhì)粒的鑒定。 ③構(gòu)建pcGI重組質(zhì)粒。 ④pcGI重組質(zhì)粒的鑒定。 (3)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1基因修飾對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的影響 ①脂質(zhì)體介導(dǎo)IGF-1基因轉(zhuǎn)染MSCs及鑒定。 ②觀察轉(zhuǎn)染后的MSCs，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。 ③Western blot檢測(cè)IGF-1、ColⅡ蛋白表達(dá)，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)所得比值

5、進(jìn)行方差分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 一、兔MSCs的分離、培養(yǎng)和傳代成功 1、細(xì)胞懸液接種于塑料培養(yǎng)瓶后，細(xì)胞大多為圓形單核細(xì)胞，散在均勻分布，接種第7天，細(xì)胞貼壁融合率達(dá)80％-85％，部分融合成片狀，呈旋渦狀生長(zhǎng)。傳代后的細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，大多于傳代后12小時(shí)內(nèi)貼壁、伸展，為長(zhǎng)梭形細(xì)胞，生長(zhǎng)潛伏期較短，7-10天后長(zhǎng)滿瓶底，增殖生長(zhǎng)迅速。各代細(xì)胞形態(tài)基本一致，都為長(zhǎng)梭形。 2、經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，培養(yǎng)細(xì)胞表面標(biāo)

6、志CD29和CD44表達(dá)陽(yáng)性，CD14和CD45表達(dá)陰性。 3、繪制P<,1>、P<,3>、P<,5>代次細(xì)胞生長(zhǎng)曲線后，通過(guò)分析可以看出，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞的增殖能力變化不大。 二、成功構(gòu)建了含有GFP和IGF-1基因的真核表達(dá)載體 1、質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1的擴(kuò)增及純化成功。 2、真核表達(dá)載體的酶切鑒定證實(shí)pcDNA3.1-IGF-1內(nèi)含有IGF-1cDNA片段。 3、ocDN

7、A3.1-IGF-1內(nèi)插入的IGF-1 cDNA片段序列與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致。 4、pcGI真核表達(dá)載體的酶切鑒定表明所構(gòu)建的質(zhì)粒方向及大小正確。 三、經(jīng)IGF-1基因修飾的MSCs能夠穩(wěn)定表達(dá)Ⅱ型膠原蛋白 1、脂質(zhì)體介導(dǎo)IGF-1基因轉(zhuǎn)染MSCs后，熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞可激發(fā)出綠色熒光。 2、轉(zhuǎn)染后24小時(shí)基因轉(zhuǎn)染效率約為(30±2.5)％。 3、Western blot測(cè)定IGF-

8、1表達(dá)和Ⅱ型膠原(Collagen Ⅱ)蛋白表達(dá)凈灰度值轉(zhuǎn)染組明顯高于空載體組和未轉(zhuǎn)染組。 結(jié)論: 1、密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)篩選法相結(jié)合體外培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，可以提高干細(xì)胞分離純化效率，使體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，從而進(jìn)一步證明了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以作為組織工程中理想的種子細(xì)胞。 2、成功構(gòu)建了含有GFP和IGF-1基因的真核表達(dá)載體。 3、經(jīng)IGF-1基因修飾的MSCs表達(dá)IGF