TritonX-100促進脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞及毒性的實驗研究.pdf

1、 目的：探討TritonX-100促進脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的作用及TritonX-100對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞活性的影響。方法：1、Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)的原代取材和傳代培養(yǎng)。2、用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH5α 大腸桿菌的方法擴增構(gòu)建好的質(zhì)粒pegfp-BMP2-N1,pegfp-VEGF165-N1。3、通過噻唑藍MTT法,在酶聯(lián)免疫檢測儀上測得492 nm波長處的吸光度(OD)值,確定TritonX-

2、100用于促進脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的最佳濃度。4、在Triton X-100適宜濃度下,脂質(zhì)體介導(dǎo)BMP2與VEGF轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞。實驗分7組,細胞空白組、BMP2 常規(guī)轉(zhuǎn)染組、VEGF 常規(guī)轉(zhuǎn)染組、BMP2 實驗組、VEGF實驗組、BMP2無脂質(zhì)體組、VEGF無脂質(zhì)體組。細胞空白組為骨髓間充質(zhì)干細胞,只含無血清培養(yǎng)基；BMP2 與 VEGF 常規(guī)轉(zhuǎn)染組,按Lipofect2000使用說明書上的步驟進行轉(zhuǎn)染；VEGF與BMP2實驗組

3、,在脂質(zhì)體復(fù)合物滴加到培養(yǎng)孔中混勻后,加入適宜濃度的X-100 混勻,其余步驟同常規(guī)轉(zhuǎn)染組；BMP2 與 VEGF 無脂質(zhì)體組,不加脂質(zhì)體Lipofect2000,只加入適宜濃度的Triton X-100和無血清培養(yǎng)基。5、在轉(zhuǎn)染48小時后,用倒置熒光顯微鏡觀察實驗組及對照組中熒光蛋白的表達情況。6、轉(zhuǎn)染72h后,做實時熒光定量PCR,主要檢測各組中BMP2和VEGF165在轉(zhuǎn)染72h后表達水平的相對差異。本試驗采用相對定量 2-△△C

4、t法來檢驗基因的表達變化。7、實驗數(shù)據(jù)常規(guī)進行方差齊性檢驗、正態(tài)性檢驗。采用t檢驗比較單變量兩組資料,單因素方差分析比較多組資料,非參數(shù)檢驗比較方差不齊者,計數(shù)資料采用卡方檢驗,以 P<0 . 05 為差別有統(tǒng)計學意義。采用SPSSl2.0統(tǒng)計軟件處理分析。結(jié)果：1、Triton X-100用于促進脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的最佳濃度為 0.005%,經(jīng) MTT 法測得的 OD 值為0.145,與空白細胞OD值0.151相比,P<0.05,無統(tǒng)

5、計學意義,說明在這個濃度下,Triton X-100 對細胞的生長沒有影響。2、轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染48h后,在置熒光顯微鏡下觀察到BMP2、VEGF常規(guī)轉(zhuǎn)染組和BMP2、VEGF實驗組有熒光表達,而細胞空白組和BMP2、VEGF無脂質(zhì)體組無熒光蛋白的表達,肉眼觀察下,常規(guī)轉(zhuǎn)染組與實驗組的熒光表達的數(shù)量有差別。3、BMP2、VEGF常規(guī)轉(zhuǎn)染組和BMP2、VEGF實驗組于轉(zhuǎn)染后第3天,實驗組BMP2的相對表達量5.94,常規(guī)轉(zhuǎn)染組為4.99,其轉(zhuǎn)染效

6、率提高了19%；實驗組VEGF的相對表達量3.48,常規(guī)轉(zhuǎn)染組為 2.77,其轉(zhuǎn)染效率提高了 25.6%。實驗組與常規(guī)轉(zhuǎn)染組的 BMP2與VEGF表達水平有差異,P<0.05。結(jié)論：1、Triton X-100可以促進脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,提高其19%-25.6%的轉(zhuǎn)染效率。2、Triton X-100用于促進脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的最適濃度為0.005%,在這個濃度下,Triton X-100 對細胞的生長沒有影響。3、