骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞株相互作用后對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞APRIL、FAP、BAFF、IGF-1和基因表達(dá)譜的影響.pdf

1、目的：研究正常骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC)與骨髓瘤細(xì)胞株相互作用過程中,對BMMSC成纖維細(xì)胞激活蛋白(FAP)、增殖誘導(dǎo)配體(APRIL)、B細(xì)胞激活因子(BAFF)和胰島素樣生長因子(IGF-1)在mRNA表達(dá)水平以及對全基因表達(dá)譜的影響。
　　 方法：1、RT-PCR方法測定FAP、APRIL、BAFF和IGF-1在共培養(yǎng)前后BMMSC基因表達(dá)分3組:1)對照組A:BMMSC單獨培養(yǎng)7天(n=9);2)實驗組B:BMMS

2、C與U266細(xì)胞Transwell非直接接觸共培養(yǎng)7、12天(n=9);3)實驗組C:BMMSC與RPMI8226細(xì)胞Transwell非直接接觸共培養(yǎng)7、12天(n=9)。A、B、C組細(xì)胞部分收集提取總RNA,Real-TimePCR.法測定BMMSC中FAP、APRIL、BAFF、IGF-1mRNA表達(dá)水平,并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析比較。
　　 2、BMMSC全基因組表達(dá)芯片檢測。分為對照組、與骨髓瘤細(xì)胞株共培養(yǎng)組,以及共培養(yǎng)后繼續(xù)

3、培養(yǎng)組。1)對照組:BMMSC單獨培養(yǎng)7天(n=3);2)共培養(yǎng)組:BMMSC與骨髓瘤細(xì)胞(U266混合RPMl8226細(xì)胞)Transwell非直接接觸共培養(yǎng)7天(n=3);3)共培養(yǎng)后繼續(xù)培養(yǎng)組:BMMSC與骨髓瘤細(xì)胞(U266混合RPMI8226細(xì)胞)Transwell非直接接觸共培養(yǎng)7天去除骨髓瘤細(xì)胞株后繼續(xù)在L-DMEM條件下培養(yǎng)7天(n=3)。培養(yǎng)結(jié)束后將上述三組BMMSC收集后,全基因組表達(dá)芯片檢測。通過基因芯片方法比較對

4、照組、共培養(yǎng)組和繼續(xù)培養(yǎng)組BMMSC基因表達(dá)改變,并通過RT-PCR方法進(jìn)一步證實。
　　 3、A、B、C組細(xì)胞成骨分化:將A、B、C組BMMSCs在7天和12天時間點加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液,誘導(dǎo)時間為21天,取BMMSCs分別進(jìn)行堿性磷酸酶(NAP)和茜素紅(ARS)染色以檢測BMMSCs的成骨分化能力。
　　 結(jié)果：1、倒置顯微鏡下觀察,A、B、C組BMMSC形態(tài)均以長梭形為主,呈貼壁生長,BMMSC形態(tài)無明顯差異。

5、r>　　 2、檢測BMMSC成骨能力:采用ARS染色及NAP染色方法結(jié)果顯示:經(jīng)過成骨誘導(dǎo)21天后,A、B、C組BMMSC均具有成骨分化能力;ARS結(jié)果顯示:與A組相比,B、C組BMMSC鈣結(jié)節(jié)減少,提示成骨分化能力減弱。
　　 3、Real-time-PCR結(jié)果顯示:與A組相比,B、C組的FAP、APRIL、BAFF和IGF-1基因表達(dá)水平有改變。骨髓瘤細(xì)胞(U266和RPMI8226)與BMMSC共培養(yǎng)后,BMMSC的基因

6、表達(dá)發(fā)生改變,結(jié)果如下:
　　 (1)實驗組B、C組在7d時間點上APRIL基因mRNA相對拷貝數(shù)分別為0.7078±0.1855和0.7978±0.4585,均明顯低于對照組A,且P值分別為0.0139和0.005;均P＜0.05。實驗組B、C組在12d時間點上APRIL基因mRNA相對拷貝數(shù)分別為1.3584±0.7119和1.059±0.8817,與A組相比沒有明顯改變,P值分別為0.5718和0.1474,均P＞0.05

7、。
　　 (2)實驗組B、C組在7d時間點上FAP基因mRNA相對拷貝數(shù)分別為1.593±0.9007和1.363±1.107;均明顯低于對照組,P值分別為0.0085和0.0082;均P＜0.01。實驗組B、C組在12d時間點上FAP基因mRNA相對拷貝數(shù)分別為2.101±1.174和1.989±1.702;與A組相比沒有明顯統(tǒng)計學(xué)差異;P值分別為0.9126和0.7477,均P＞0.05。
　　 (3)實驗組B、C組

8、在7d時間點上BAFF基因mRNA相對拷貝數(shù)分別為2.874±3.514和1.752±1.439;與A組相比,沒有統(tǒng)計學(xué)差異,P值分別為0.8049和0.2117;均P＞0.05。實驗組B、C組在12d時間點上BAFF基因mRNA相對拷貝數(shù)分別為4.636±3.622和3.274±2.614;與A組相比,沒有統(tǒng)計學(xué)差異,P值分別為0.1145和0.4685,均P＞0.05。
　　 (4)實驗組B、C組在7d時間點上IGF-1基因

9、同mRNA相對拷貝數(shù)分別為1.245±1.231和1.583±1.947;與A組相比,沒有統(tǒng)計學(xué)差異,P值分別為0.5561和0.8177,均P＞0.05。實驗組B、C組在12d時間點上IGF-1基因mRNA相對拷貝數(shù)分別為2.435±2.091和2.028±2.010;與A組相比,沒有統(tǒng)計學(xué)差異,P值分別為0.6217和0.8307,均P＞0.05。
　　 4、基因芯片結(jié)果:與對照組相比,共培養(yǎng)組和共培養(yǎng)后繼續(xù)培養(yǎng)組的BMMS

10、C基因表達(dá)譜發(fā)生改變。例如:(1)與陰性對照組相比,共培養(yǎng)組(與骨髓瘤細(xì)胞株Transwell共培養(yǎng)7天)的BMMSC的FGFR2、MFAP5基因表達(dá)降低;而MMP-1和ANGPTL4表達(dá)增高。(2)與陰性對照組相比,共培養(yǎng)后繼續(xù)培養(yǎng)組(Transwell共培養(yǎng)7天后去除共培養(yǎng)體系中的骨髓瘤細(xì)胞株再將BMMSC繼續(xù)在L-DMEM中培養(yǎng)7天)的BMMSC的TGM2、STC1、CCL7、IL-32、MMP-1和ANGPTL4基因表達(dá)升高。進(jìn)

11、一步通過RT-PCR方法支持以上基因芯片的結(jié)果。
　　 結(jié)論：1、和對照組相比,實驗組細(xì)胞的生長形態(tài)基本一致。
　　 2、和對照組相比,實驗組BMMSC的成骨分化能力下降:ARS法檢測結(jié)果為鈣結(jié)節(jié)減少。該結(jié)果提示骨髓瘤細(xì)胞抑制BMMSC的成骨分化能力。
　　 3、和對照組相比,實驗組BMMSC在7d時間點上其APRIL、FAP基因表達(dá)水平下降,并具有統(tǒng)計學(xué)意義;在12d時間點上其APRIL和FAP基因表達(dá)無明顯改

12、變,并無統(tǒng)計學(xué)意義。而7d和12dBAFF基因表達(dá)呈現(xiàn)部分上升趨勢,IGF-1并無上升趨勢,但兩者改變均無統(tǒng)計學(xué)意義;本實驗結(jié)果提示骨髓瘤細(xì)胞與BMMSC相互作用過程中,可能通過改變BMMSC的旁分泌功能,從而影響骨髓瘤的生存、生長。
　　 4、與單獨培養(yǎng)組相比,與骨髓瘤細(xì)胞株Transwell共培養(yǎng)7天及繼續(xù)培養(yǎng)組的BMMSC基因表達(dá)譜發(fā)生改變。
　　 5、在多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病過程中,骨髓瘤細(xì)胞通過與周圍微環(huán)境中的細(xì)胞