轉前強啡肽基因修飾人骨髓間充質干細胞株的建立及鎮(zhèn)痛效應研究.pdf

1、目的和背景：
　　各種原因引起的慢性疼痛是臨床工作中的棘手問題之一，它不僅影響患者的生活質量，也逐漸成為了一項社會負擔，但關于這方面的治療進展甚為緩慢，目前已有的藥物療效尚不盡人意，這迫切需要我們醫(yī)學工作者尋求更安全有效的治療方法。
　　經多年的研究證實，生物鎮(zhèn)痛具有廣闊的發(fā)展前景，但目前目的基因、移植細胞和載體的研究尚在進行中。前期研究已證實內分泌肽家族之一的腦啡肽具有鎮(zhèn)痛、免疫調節(jié)等作用，但要達到理想的鎮(zhèn)痛效果需要較大的

2、劑量。后續(xù)有研究表明κ受體激動劑強啡肽（dynorphin，Dyn）作為一種內源性鎮(zhèn)痛介質，廣泛分布于外周和中樞神經系統，其生物鎮(zhèn)痛活性比腦啡肽強700倍，Long等[1]發(fā)現大鼠蛛網膜下腔注射Dyn的鎮(zhèn)痛劑量僅為2.5～5.0 nmol就可以達到滿意的鎮(zhèn)痛效果，更適用于生物鎮(zhèn)痛研究。骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）因為具有低免疫原性、多向分化潛能及定向歸巢等生物學特性

3、，成為理想的移植細胞。本實驗研究擬以重組腺病毒載體為基礎，將前強啡肽基因（prodynorphoin,PDP）導入到人骨髓間充質干細胞（hBMSCs），獲得能表達強啡肽基因及分泌強啡肽蛋白的干細胞株（hBMSCs-PDP），并移植入坐骨神經慢性壓迫性損傷（chronic constriction injury，CCI）模型的大鼠髓鞘內，利用BMSCs的定向歸巢和定向分化的特性，實現靶向性轉基因細胞鎮(zhèn)痛，評價其鎮(zhèn)痛效應，為生物鎮(zhèn)痛技術的發(fā)

4、展和臨床應用奠定基礎。
　　1.材料和方法：
　　1.1重組腺病毒Ad5F35-PDP
　　前期實驗肖建斌等[2]人已成功構建用Ad5F35載體制備攜帶前強啡肽原基因的重組腺病毒Ad5F35-PDP并饋贈于本實驗研究。該實驗運用第5代腺病毒Ad5F35，通過與AdMaxTM系統進行同源重組，制備了含前強啡肽（prodynorphin，PDP）基因全序列的Ad5F35-PDP重組腺病毒，并對其進行了滴度測定，為本實驗對該

5、重組腺病毒的生物學功能研究及今后的轉基因治療奠定了良好的基礎。
　　1.2重組腺病毒Ad5F35-PDP轉染人骨髓間充質干細胞hBMSCs
　　本實驗以重組腺病毒Ad5F35-PDP為載體，將前強啡肽基因（PDP)導入人骨髓間充質干細胞（hBMSCs），獲得具有分泌強啡肽特性的細胞株，同時探討轉基因建立的細胞株hBMSCs-PDP的的增殖情況、細胞活力、傳代過程中細胞形態(tài)學是否發(fā)生改變，以及目的基因強啡肽的表達情況。最后通過

6、體內實驗，將轉基因細胞株hBMSCs-PDP移植入神經病理性疼痛大鼠髓鞘內，利用hBMSCs在體內定向歸巢和定向分化的特點，驗證hBMSCs-PDP靶向性轉基因細胞的鎮(zhèn)痛效果。
　　1.3神經病理性疼痛模型大鼠髓鞘內注射hBMSCs-PDP的鎮(zhèn)痛效果
　　取健康雄性SD大鼠40只（實驗過程中各種原因淘汰的大鼠均由后續(xù)實驗補齊），體重150～180 g，周齡6～8周，隨機分為4組（n=10），A組為正常對照組；B組、C組和D組

7、均行髓鞘內置管，導管固定于大鼠背部皮下，且均在大鼠右腿（術側）通過坐骨神經慢性壓迫性損傷法（CCI）建立神經病理性疼痛模型，于CCI術后3 d分組給藥。B組髓鞘內注射無菌生理鹽水20μl；C組鞘內注射轉染空載體48h的hMSCs細胞懸液(hMSCs-空載體)20μl（1×106-2×106/μl）；D組鞘內注射轉染目的基因前強啡肽原48h的hMSCs細胞懸液（hMSCs-PDP）20μl（1×106-2×106/μl）。于手術前1d、手

8、術后第3、5、7、9、11、13d分別測定SD大鼠右腿（術側）熱痛閾值。分別于術后第7d和第13d測完SD大鼠術側熱痛閾值后，取SD大鼠的新鮮脊髓組織，行免疫組化檢測脊髓后角強啡肽的表達情況，采用RT-PCR法測定PDP mRNA的表達，western blot法測定PDP蛋白的分泌，最后用裸鼠致瘤實驗檢驗hMSCs-PDP細胞系的安全性。
　　2統計分析
　　采用SPSS13.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（

9、 SDX±）表示。組間及組內均數的比較采用重復測量設計方差分析；兩兩比較采用LSD分析，以 P<0.05為差異有意義。
　　3結果：
　　1）重組腺病毒 Ad5F35-PDP成功轉染人骨髓間充質干細胞（hBMSCs），并建立hBMSCs-PDP細胞株用于后續(xù)實驗。
　　2） SD大鼠坐骨神經慢性壓迫性損傷法（CCI）神經病理性疼痛模型提示：與A組比較， B組、C組、D組熱痛閾值降低(P<0.05)。與B組、C組比較，D

10、組熱痛閾值升高（P<0.05）。RT-PCR結果提示D組脊髓組織強啡肽mRNA表達比A組、B組、C組升高。免疫組化結果顯示：D組強啡肽表達較B組和C組增強。最后將轉基因細胞株注入裸鼠體內，觀察一個月后未發(fā)現致畸致瘤性，表明注入的hBMSCs-PDP細胞系是安全的。
　　4結論：
　　1）重組腺病毒Ad5F35-PDP可成功轉染人骨髓間充質干細胞。
　　2）大鼠髓鞘內注射hBMSCs-PDP可減輕CCI模型SD大鼠的神經