人前腦啡肽基因修飾的人骨髓間充質(zhì)干細胞系鎮(zhèn)痛效應(yīng)的研究.pdf

1、背景和目的：
　　慢性疼痛的發(fā)病率已高達30％[1]且較頑固,不易緩解,嚴重的影響了人類的生理及心理健康,目前解決慢性疼痛的醫(yī)學(xué)手段尚存在缺陷,因此尋找一種安全有效的治療方法是醫(yī)學(xué)工作者為之奮斗的目標(biāo)。轉(zhuǎn)基因細胞鎮(zhèn)痛是適應(yīng)這一時代的產(chǎn)物,近些年來的研究都表明了其在鎮(zhèn)痛領(lǐng)域的可行性,而移植細胞成為這一問題的關(guān)鍵。目前髓間充質(zhì)干細胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)成為各學(xué)科研究的熱點,也同樣

2、引起了疼痛工作者的極大興趣,由于其可取至自體骨髓,取材方便,因此不存在目前移植較棘手的組織配型及免疫排斥等問題。另外其具有的定向分化及歸巢的生物學(xué)特性,致使可以通過不同的方式給藥,更具有臨床指導(dǎo)意義。慢性縮窄性損傷(chronicconstrictioninjury,CCI)模型是基礎(chǔ)研究中最常用的神經(jīng)病理性疼痛模型。其造模簡單,成功率高,疼痛持續(xù)時間長等特點[2],使其得到大家的推崇。本實驗是在CCI模型的基礎(chǔ)上,擬檢驗本實驗室前期已

3、經(jīng)制備成功的可穩(wěn)定分泌鎮(zhèn)痛物質(zhì)的人前腦啡肽原(PENK)基因修飾骨髓間充質(zhì)干細胞(hMSC)的鎮(zhèn)痛效果。
　　材料和方法：
　　1.神經(jīng)病理性痛大鼠鞘內(nèi)注射人前腦啡肽原基因修飾骨髓間充質(zhì)干細胞的鎮(zhèn)痛效果
　　取鞘內(nèi)置管成功的健康雄性SD大鼠40只,周齡6～8周,體重160～180g,隨機分為4組(n=10),A組為正常對照組;B組、C組和D組采用坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷法(CCI)建立神經(jīng)病理性痛模型,于CCI術(shù)后3d鞘

4、內(nèi)給藥,A組和B組鞘內(nèi)注射生理鹽水10μl;C組鞘內(nèi)注射與BrdU共培養(yǎng)72h轉(zhuǎn)染空載體的hMSC細胞(hMSC-pBABE)細胞懸液10μl(2×108～3×108/μl);D組鞘內(nèi)注射與BrdU共培養(yǎng)72h的hMSC-PENK細胞懸液10μl(2×108～3×108個/μl)。于術(shù)前、術(shù)后3、5、7、9、11、14d時測定熱痛閾。術(shù)后14d痛閾測定后取新鮮脊髓組織,行免疫組化檢測腦啡呔表達及細胞存活情況,免疫熒光法及酶聯(lián)免疫吸附測定

5、(Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)法檢測各組大鼠腦啡呔含量,采用RT-PCR法測定PENKmRNA表達,另采用免疫熒光法檢測hMSC細胞分化情況。
　　2.神經(jīng)病理性痛大鼠靜脈注射人前腦啡肽原基因修飾骨髓間充質(zhì)干細胞的鎮(zhèn)痛效果
　　取按照Bennett法[2]手術(shù)制備CCI模型成功的健康雄性SD大鼠40只,周齡6～8周,體重160～180g,隨機分為4組(n=10),A組為對照組;B

6、組、C組和D組行尾靜脈置管術(shù),于CCI術(shù)后3d靜脈注入各組細胞,B組靜脈注射生理鹽水1ml;C組靜脈注射與BrdU共培養(yǎng)72h轉(zhuǎn)染空載體的hMSC細胞(hMSC-pBABE)細胞懸液1ml(2×108～3×108/ml);D組靜脈注射與BrdU共培養(yǎng)72h的hMSC-PENK細胞懸液10μl(2×108～3×108/ml)。于術(shù)前、術(shù)后3、5、7、9、11、14d時測定熱痛閾。術(shù)后14d痛閾測定后取新鮮脊髓組織,行免疫組化檢測腦啡呔表達

7、及細胞存活情況,酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)法檢測各組大鼠腦啡呔含量。另采用裸鼠致瘤實驗檢驗該細胞系的安全性。
　　3.統(tǒng)計分析
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析,實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SDX±)表示。經(jīng)正態(tài)和方差齊性檢驗后,組間及組內(nèi)均數(shù)的比較采用重復(fù)測量設(shè)計方差分析及單因素方差分析(One-WayANOVA);兩兩比較采用LSD分析,以P<0.0

8、5為差異有顯著意義。
　　結(jié)果：
　　1.鞘內(nèi)給藥組,與術(shù)前比較,B組、C組、D組術(shù)后各時點熱痛閾降低(P<0.05)。與A組比較,B組、C組、D組熱痛閾降低,B組和C組PENKmRNA表達下調(diào),D組PENKmRNA表達上調(diào)(P<0.05)。與B組和C組比較,D組熱痛閾升高,PENKmRNA表達上調(diào)(P<0.05)。B組和C組各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。免疫組化及ELISA結(jié)果顯示均D組腦啡呔表達較B組和C組

9、升高,B組和C組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。術(shù)后14天在大鼠脊髓組織中仍可檢測BrdU標(biāo)記的hMSC細胞。免疫熒光檢測鞘內(nèi)注入hMSC細胞的C組和D組星形膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元表達上調(diào),部分細胞可分化為神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞。
　　2.靜脈給藥組,與術(shù)前比較,B組、C組、D組術(shù)后各時點熱痛閾降低(P<0.05)。與A組比較,B組、C組、D組熱痛閾降低。與B組和C組比較,D組熱痛閾升高(P<0.05)。免疫組化及ELISA結(jié)果顯示均D組腦啡呔表達較B

10、組和C組升高,B組和C組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。術(shù)后3天在大鼠脊髓組織中仍檢測到BrdU標(biāo)記的hMSC細胞。裸鼠致瘤實驗表明注入hMSC-PENK細胞系未產(chǎn)生腫瘤。
　　結(jié)論：
　　1.大鼠鞘內(nèi)注射PENK基因修飾的hMSC可減輕神經(jīng)病理性痛。
　　2.靜脈注射PENK基因修飾的hMSC可定向歸巢至中樞神經(jīng)系統(tǒng),發(fā)揮鎮(zhèn)痛效果。
　　3.該細胞系未發(fā)現(xiàn)致瘤致畸性,因此該細胞用于細胞鎮(zhèn)痛的載體細胞是安全的,可用于神經(jīng)病理性