人前腦啡肽基因修飾的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系的構(gòu)建及其生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的:
　　 慢性疼痛的治療是目前人類尚未解決的難題之一，嚴(yán)重地影響了人類的生活質(zhì)量，由于目前臨床使用的鎮(zhèn)痛藥物存在的缺陷，療效不能令人滿意。生物鎮(zhèn)痛由于其模擬人體生理分泌的獨(dú)有的特點(diǎn)，具有明顯的優(yōu)勢(shì)，是未來(lái)疼痛治療的新方向，而轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植鎮(zhèn)痛（Transplantation of transgeneic cells for analgesia）則是其中的最具有的發(fā)展?jié)摿Φ姆较颉?br>　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone

2、 marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）來(lái)源豐富，組織相容性好，免疫原性低，具有多向分化潛能，是較為理想的移植細(xì)胞。內(nèi)源性阿片肽腦啡肽，廣泛分布于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system, CNS)，是一種重要的鎮(zhèn)痛介質(zhì)。本研究擬利用RT-PCR 法構(gòu)建人前腦啡肽基因（proenkephalin, PENK）的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，建立能表達(dá)前腦啡肽基因及分泌腦啡肽蛋白的人骨髓間充

3、質(zhì)干細(xì)胞系并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性的鑒定，為疼痛的基因治療的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 材料和方法:
　　 1 攜帶人前腦啡肽基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建從人腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織中提取總RNA，RT-PCR 法擴(kuò)增出前腦啡肽基因全長(zhǎng)cDNA，經(jīng)測(cè)序正確后，核酸內(nèi)切酶EcoR I、Sal I酶切PCR 產(chǎn)物，定向克隆入pBABE puro載體，重組質(zhì)粒pBABE-PENK經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定。
　　 2 人前腦啡肽基因修飾的人

4、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性研究采用直接貼壁法從人骨髓標(biāo)本中分離hMSCs。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)將重組質(zhì)粒pBABE-PENK 轉(zhuǎn)染包裝病毒細(xì)胞株P(guān)HOENIX-293T 細(xì)胞，收集病毒上清，將其感染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)過(guò)嘌呤霉素篩選得穩(wěn)定表達(dá)PENK的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞系。選用連續(xù)傳代培養(yǎng)人前腦啡肽基因修飾的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系的和未轉(zhuǎn)化的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察傳代、凍存和復(fù)蘇對(duì)細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)的影響；比較兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)特性和

5、繪制生長(zhǎng)曲線；流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染兩組細(xì)胞的表面標(biāo)志CD44，CD29，CD34，CD45的表達(dá)。將轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞分別行成脂誘導(dǎo)及成骨誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后脂肪細(xì)胞油紅染色，成骨細(xì)胞茜素紅染色觀察。分別用RT-PCR方法檢測(cè)PENK基因的表達(dá)、免疫熒光法及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法測(cè)定亮氨酸腦啡肽(Leu-enkephalin,LEK）的表達(dá)。
　　 3 統(tǒng)計(jì)分析：

6、r>　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD X ± )或均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（X S X ± )表示。定量資料經(jīng)正態(tài)和方差齊性檢驗(yàn)后，組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析及雙因素析因分析，組間兩兩比較采用LSD方法分析，以p<0.05 作為差異有顯著意義的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件包處理。
　　 結(jié)果:
　　 1 重組質(zhì)粒pBABE-PENK經(jīng)EcoR I、Sal I酶切及測(cè)序鑒定正確，重組質(zhì)粒包含人PENK基因完整編碼

7、區(qū)。
　　 2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系可在體外連續(xù)傳代至20代以上；傳代、凍存和復(fù)蘇對(duì)細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)無(wú)影響（P=0.386）。與第4代hMSCs相比，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長(zhǎng)情況沒(méi)有明顯差異（P=0.873）。
　　 流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞表明標(biāo)志沒(méi)有明顯差異：CD29（P=0.136）、CD44（P=0.352）
　　 表達(dá)均（+），而CD34（P=0.466）、CD45（P=0.474）表達(dá)均（-）；轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞均可在體外

8、培養(yǎng)條件上誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞，與第4代hMSCs 相比，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞成脂分化能力沒(méi)有明顯差異（P=0.944）。RT-PCR 及免疫熒光法證實(shí)hMSC-PENK中PENK基因表達(dá)水平升高且細(xì)胞內(nèi)LEK含量升高， ELISA法檢測(cè)到細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LEK表達(dá)量增高（P<0.001）。
　　 結(jié)論:
　　 1 成功構(gòu)建了含人前腦啡肽原基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
　　 2 成功構(gòu)建了人前腦啡肽原基因修飾的人骨髓間充