不同基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及誘導(dǎo)新骨形成能力的研究.pdf

1、研究背景 骨缺損是指由于外傷、感染、腫瘤切除等因素造成骨質(zhì)喪失，從而在骨組織中形成間隙。較小范圍的骨缺損可以由機(jī)體自身的再生得到修復(fù)，而較大間隙的骨缺損則由于成骨細(xì)胞難以越過而不能正常愈合，若不采用適當(dāng)治療則最終僅由纖維組織充填，形成骨不連。有研究表明，當(dāng)長骨骨干缺損長度超過其直徑的1.5～2.5倍時(shí)，機(jī)體便難以自行愈合，因而造成永久性骨不連。骨缺損的病人在骨科患者中占有很高的比例，大約有10～15％的病人需要進(jìn)行骨移植治療。在

2、美國，每年涉及骨移植的病例已超過100萬，而在我國這樣一個(gè)人口眾多的發(fā)展中國家，需要進(jìn)行骨移植治療的病例數(shù)目巨大更是不言而喻的，并且隨著社會的發(fā)展，交通事故的增多，骨缺損病人數(shù)目更是在不斷地逐年攀升，現(xiàn)今已經(jīng)發(fā)展成為嚴(yán)重威脅人們生活質(zhì)量的主要病癥之一。 目前，主要應(yīng)用于臨床骨缺損修復(fù)的方法有自體骨移植和異體骨移植等，但自體骨移植存在材料來源有限、供骨部位的損傷以及塑形困難等問題：異體骨移植也有潛在的疾病傳播隱患以及移植排斥反應(yīng)等

3、嚴(yán)重后果，因此無論自體骨移植還是異體骨移植均無法完全滿足需求，臨床急需尋找一種安全有效的骨移植替代材料。近年來隨著組織工程化人工骨的誕生，骨移植治療中材料短缺的問題將有望得到成功的解決。組織工程骨是由可吸收的支架材料、種子細(xì)胞和／或成骨促進(jìn)因子構(gòu)成的。近年來，將細(xì)胞與特定支架材料聯(lián)合培養(yǎng)，形成具有生命的活性組織工程化復(fù)合材料用于修復(fù)骨缺損已經(jīng)取得了初步成效，但毫無疑問，如何構(gòu)建更理想的組織工程化人工骨仍舊是一個(gè)值得被重視的熱點(diǎn)。

4、 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）作為組織工程的優(yōu)秀種子細(xì)胞之一，具有很強(qiáng)的成骨分化潛力，在特定的環(huán)境中能夠被誘導(dǎo)分化成為成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨修復(fù)過程，因此被廣泛應(yīng)用與骨組織工程領(lǐng)域；另外，很多國內(nèi)外的研究也發(fā)現(xiàn)，有許多成骨分化因子以及血管誘導(dǎo)因子局部使用均有促進(jìn)骨再生的作用。但單純的MSCs與材料的復(fù)合物誘導(dǎo)骨化過程很慢，而細(xì)胞因子局部給藥持續(xù)時(shí)間短、需反復(fù)給藥，并且價(jià)格非常昂貴?；诮陙硖岢龅?/p>

5、內(nèi)源性骨生長因子治療骨折的新理論，基因治療的手段被逐漸應(yīng)用到骨組織工程領(lǐng)域中，并充分展現(xiàn)出了巨大的潛力，它使我們能夠?qū)⒕幋a各種細(xì)胞因子的基因?qū)氲組SCs中，復(fù)合適當(dāng)材料后植入骨缺損部，這樣就能夠在局部持續(xù)高效地產(chǎn)生細(xì)胞因子，以自分泌和旁分泌地方式誘導(dǎo)MSCs和組織中間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。 本實(shí)驗(yàn)中，我們以大鼠MSCs作為轉(zhuǎn)基因的靶細(xì)胞，分別將骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic prot

6、ein 2，BMP-2）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的基因分別導(dǎo)入MSCs中，并且首次將BMP-2、bFGF基因以及BMP-2、VEGF基因共同導(dǎo)入MSCs中，分別在體內(nèi)和體外觀察對比了這幾種基因單獨(dú)修飾和共同修飾對rMSCs細(xì)胞活性的影響以及誘導(dǎo)異位成骨的情況，

7、為構(gòu)建更優(yōu)化的骨組織工程種子細(xì)胞和組織工程化骨提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法 1．BMP-2，VEGF165，bFGF基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建 提取腦組織和骨髓組織RNA，反轉(zhuǎn)錄成eDNA，通過PCR方法自cDNA庫中獲取全長BMP-2、VEGF165及bFGF基因，酶切連接克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.0，測序并與Genebank中序列進(jìn)行比較分析。 2．不同基因遺傳修飾的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的建立

8、 （1）采用Percoll分離液密度梯度離心和差速貼壁傳代篩選法相結(jié)合，分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 （2）以脂質(zhì)體介導(dǎo)分別將真核表達(dá)質(zhì)粒peDNA3.0-BMP2、pcDNA3.0-VEGF和pcDNA3.0-bFGF單獨(dú)轉(zhuǎn)染MSCs，pcDNA3.0-BMP2和pcDNA3.0-VEGF以及peDNA3.0-BMP2和pcDNA3.0-bFGF共同轉(zhuǎn)染MSCs，G418壓力篩選穩(wěn)定表達(dá)株。 （3）RT-PCR檢測

9、各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中目的基因mRNA表達(dá)情況；Western blot、細(xì)胞免疫化學(xué)檢測各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞胞漿中目的蛋白表達(dá)情況；ELISA檢測各各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清中目的蛋白的分泌情況。 3.不同基因修飾的rMSCs細(xì)胞生物學(xué)特性分析 將外源基因修飾的MSCs分為6組進(jìn)行：A.MSCs對照組；B.BMP-2基因修飾組；C.VEGF165基因修飾組；D.bFGF基因修飾組；E.BMP-2和VEGF基因聯(lián)合修飾組；F.BMP-2和bF

10、GF基因聯(lián)合修飾組。 （1）采用MTT方法測定各組細(xì)胞增殖能力； （2）酶促反應(yīng)檢測細(xì)胞堿性磷酸酶活性； （3）放射免疫法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中骨鈣素含量。 4．不同基因轉(zhuǎn)染的rMSCs成骨活性的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究 實(shí)驗(yàn)共分為6組進(jìn)行：A.rMSCs+AW-GC對照組；B.BMP-2基因修飾rMSCs+AW-GC組；C.VEGF基因修飾rMSCs+AW-GC組；D.bFGF基因修飾rMSCs+AW-GC

11、組；E.BMP-2和VEGF基因聯(lián)合修飾rMSCs＋AW-GC組：F.BMP-2和bFGF基因聯(lián)合修飾rMSCs+AW-GC組。 （1）在體外分別將不同種基因轉(zhuǎn)染的rMSCs接種于多孔支架材料AW-GC上。 （2）將不同種細(xì)胞/材料復(fù)合物植入裸鼠后腿肌袋。 （3）每組分別于植入后1、2、3月取材，石蠟包埋，組織病理學(xué)切片，HE、Masson染色分析新骨形成情況； （4）免疫組織化學(xué)CD31染色，分析新骨形

12、成區(qū)域內(nèi)新生血管密度。 結(jié)果 1．RT-PCR自腦組織cDNA庫中擴(kuò)增出了VEGF165及bFGF基因，自骨髓組織eDNA庫中擴(kuò)增出了BMP-2全長基因； 2．成功將BMP-2全長基因、VEGF165基因及bFGF基因分別克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.0中，構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-BMP2、pcDNA3.0-VEGF和peDNA3.0-bFGF。DNA測序證明，所克隆目的基因序列與Genebank收

13、錄一致。 3．各種真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，經(jīng)抗生素壓力篩選獲得了具有G418抗性的細(xì)胞克隆。 4．RT-PCR結(jié)果顯示抗性細(xì)胞克隆中均有大量目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄，ELISA檢測培養(yǎng)上清中目的蛋白表達(dá)陽性，Western blot、免疫組化結(jié)果顯示胞漿中有目的蛋白的表達(dá)。 5．不同基因修飾后的MSCs增殖能力均得到不同程度的增強(qiáng)，其中bFGF和BMP-2基因的修飾以及BMP-2基因與bFGF基因或

14、VEGF基因的共同修飾對MSCs的增殖能力促進(jìn)最為明顯。 6．體外結(jié)果顯示：BMP-2基因的單獨(dú)修飾明顯上調(diào)了MSCs的堿性磷酸酶活性并促進(jìn)了骨鈣素的分泌；VEGF基因的單獨(dú)修飾對堿性磷酸酶活性有一定程度的提高，但與對照組相比骨鈣素分泌量減少：bFGF基因的單獨(dú)修飾抑制了細(xì)胞堿性磷酸酶的活性卻能夠促進(jìn)骨鈣素的大量分泌；BMP-2基因與bFGF基因或VEGF基因的共同修飾使得MSCs堿性磷酸酶活性成倍增加，骨鈣素分泌明顯上調(diào)。

15、 7．裸鼠肌袋異位誘導(dǎo)成骨實(shí)驗(yàn)顯示：各基因修飾MSCs組與單純MSCs對照組相比，材料降解和替代的速度均明顯提高，有大面積新骨形成。植入一個(gè)月后就有大量軟骨細(xì)胞和成骨樣細(xì)胞產(chǎn)生，細(xì)胞外基質(zhì)堆積，新生血管形成并深入支架材料。BMP-2基因與bFGF基因或VEGF基因共同修飾的MSCs組在各階段均有比其他組更明顯的材料替換速度，擁有更高的相對骨面積和更豐富的新生毛細(xì)血管網(wǎng)。 結(jié)論 1．人BMP-2、VEGF165和bFG

16、F基因可以通過脂質(zhì)體介導(dǎo)有效地導(dǎo)入大鼠MSCs中并得到表達(dá)。 2．BMP-2、VEGF165、bFGF基因?qū)MSCs單獨(dú)修飾，BMP-2基因與bFGF基因或VEGF基因?qū)MSCs聯(lián)合修飾后，能夠有效改變r(jià)MSCs的部分生物學(xué)特性：細(xì)胞外形發(fā)生改變，增殖能力明顯提高；細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性發(fā)生不同程度的改變；骨鈣素分泌水平變化顯著。 3．以能夠啟動或誘導(dǎo)MSCs成骨方向分化的基因（BMP-2、bFGF）和能夠促進(jìn)新生血管