BDNF基因修飾骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學特性及對豚鼠螺旋神經(jīng)元的保護作用.pdf

1、第一章、重組腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子真核表達載體構(gòu)建
　　 目的：構(gòu)建pegfpN1-BDNF真核表達載體，為體外構(gòu)建基因工程細胞奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：RT-PCR擴增人胚胎腦組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)基因片段，將基因片段與pegfpN1質(zhì)粒連接制成重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化、篩選及擴增重組質(zhì)粒，用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切分析鑒定BDNF是否插入重組質(zhì)粒。小量提取重組質(zhì)粒后進行測序分析，將酶切檢測和測序正確的pegfpN1-B

2、DNF重組質(zhì)粒用QIAGEN-TIP100大量提取。
　　 結(jié)果：經(jīng)酶切鑒定，成功地將BDNF與pegfpN1質(zhì)粒連接，構(gòu)建我們需要的pegfpN1-BDNF重組質(zhì)粒。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了pegfpN1-BDNF重組真核表達載體，為體外實驗做好準備。
　　 第二章、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞的構(gòu)建及誘導分化成神經(jīng)元樣細胞電生理特性的初步研究
　　 目的：在體外構(gòu)建能過表達BDNF的骨髓間

3、充質(zhì)干細胞(BMSCs)，并誘導該基因工程細胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元樣細胞，經(jīng)膜片鉗檢測誘導分化細胞的電生理特性。
　　 方法：采用梯度密度離心法及貼壁法分離培養(yǎng)原代BMSCs，取第二～三代細胞，流式細胞儀鑒定分離培養(yǎng)細胞表面標志物CD34、CD44、CD45表達情況。將重組真核表達載體pegfpN1-BDNF及pegfpN1分別通過電穿孔的方法轉(zhuǎn)染入BMSCs中，瞬轉(zhuǎn)48小時后流式細胞儀檢測細胞瞬時轉(zhuǎn)染效率。經(jīng)G418篩選，流式細胞儀

4、檢測轉(zhuǎn)染效率。采用全反式維甲酸誘導BDNF-BMSCs、BMSCs向神經(jīng)元樣細胞轉(zhuǎn)化，細胞免疫熒光鑒定誘導后細胞神經(jīng)特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)以及BDNF的表達情況。采用全細胞膜片鉗記錄誘導后BDNF-BMSCs的生物電特性的變化，并與未分化的BMSCs對比。
　　 結(jié)果：經(jīng)流式細胞儀

5、鑒定，所分離細胞表面標志物CD34、CD45、CD44陽性表達率分別為3.19％、4.42％、96.82％，證明了分離的細胞為BMSCs。電穿孔法BMSCs的瞬轉(zhuǎn)率為10％～15％，經(jīng)G418篩選，其轉(zhuǎn)染率達到70％～80％。經(jīng)全反式維甲酸誘導后BDNF-BMSCs組表達NSE、GFAP分別為45.87±5.82％，21.92±2.29％，未誘導BDNF-BMSCs組分別為23.90±6.95％，10.23±2.08％，而誘導的BMSC

6、s組為4.81±1.71％，1.93±1.34％。在檢測的15個誘導的BDNF-BMSCs中，膜片鉗檢測到7個細胞有似鈉離子內(nèi)向電流產(chǎn)生，與對照組比較兩組差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：BMSCs易分離及培養(yǎng)。用電穿孔法可以建立起體外穩(wěn)定高效表達BDNF的組織工程細胞BDNF-BMSCs，經(jīng)誘導可以轉(zhuǎn)分化為具有一定神經(jīng)元細胞電生理特性的神經(jīng)元樣細胞。
　　 第三章、基因工程細胞經(jīng)不同途徑移植入正常聽力豚鼠

7、耳蝸內(nèi)的比較及長期安全性的觀察
　　 目的：比較經(jīng)鼓階與蝸軸兩種不同細胞移植途徑的特點，同時長期觀察BMSCs在內(nèi)耳的分布及生長情況，為將來臨床細胞移植奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：選取40只聽力正常豚鼠，術(shù)前聽力均經(jīng)聽性腦干誘發(fā)電位(auditory brainstem response audiometry，ABR)檢測鑒定。40只豚鼠分為2組每組各20只。Ⅰ組為經(jīng)鼓階注射組，Ⅱ組為經(jīng)蝸軸注射組。將Egfp-BMSCs作為

8、移植細胞注入，術(shù)后設(shè)3個時間點測試術(shù)耳4KHZ、8KHZ、16KHZ的ABR閾值，3個時間點分別為術(shù)后7天、術(shù)后28天、術(shù)后42天。在測試ABR后，在每個時間點每組處死5只豚鼠，取耳蝸做冰凍切片觀察移植細胞在耳蝸內(nèi)的分布情況。其余10只豚鼠于術(shù)后6個月處死，觀察耳蝸大體標本并做石蠟切片，觀察其形態(tài)學改變。
　　 結(jié)果：Ⅰ組豚鼠術(shù)耳術(shù)后7天各個頻率ABR閾值較術(shù)前均有提高，術(shù)后28天恢復到術(shù)前水平，術(shù)后42天檢測ABR閾值無提高。

9、Ⅱ組豚鼠術(shù)耳術(shù)后7天各個頻率ABR閾值明顯提高，術(shù)后28天檢測ABR閾值無下降，術(shù)后42天檢測ABR閾值無改變。冰凍切片顯示：鼓階注射方式，移植細胞分布于鼓階、前庭階、中階，在蝸軸未發(fā)現(xiàn)明顯移植細胞。蝸軸注射方式，移植細胞分布于蝸軸、鼓階、前庭階、中階。隨著觀察時間的延長，在耳蝸的移植細胞逐漸減少，42天后未見明顯移植細胞。細胞移植術(shù)后6個月耳蝸大體無明顯異常，未見移植細胞過度生長致腫瘤形成，石蠟HE染色切片觀察耳蝸結(jié)構(gòu)無明顯異常。

10、r>　　 結(jié)論：鼓階注射對耳蝸創(chuàng)傷較小，是比較安全的注射方式。蝸軸注射對耳蝸創(chuàng)傷較大，但其移植細胞可在靶區(qū)定植。移植細胞在耳蝸內(nèi)能存活28～42天，BMSCs移植耳蝸內(nèi)未見致瘤性。
　　 第四章、BDNF基因修飾的BMSCs在致聾豚鼠耳蝸內(nèi)的表達與分化及對螺旋神經(jīng)元的保護作用
　　 目的：觀察BDNF-BMSCs移植入損傷耳蝸后，移植細胞是否在體內(nèi)分化成神經(jīng)元樣細胞，并觀察其對SGNs的保護作用。
　　 方法：

11、45只氨基甙類抗生素致聾模型豚鼠分為三組。三組動物經(jīng)鼓階途徑注入不同成分，A組為人工外淋巴液組；B組為體外誘導分化的BDNF-BMSCs組；C組為未誘導的BDNF-BMSCs組。在術(shù)后7天、28天、42天處死動物，取耳蝸組織石蠟包埋切片。BDNF抗體免疫組化確定移植細胞分泌情況，NSE和GFAP抗體免疫組織化學檢測移植細胞發(fā)生分化情況，用平均光密度(average optical density，AOD)分析免疫化學結(jié)果及SGNs密度。

12、
　　 結(jié)果三組動物均造模成功，ABR閾值大于75dB SPL。NSE和GFAP免疫組織化學可見B組、C組染色AOD值均大于A組(P＜0.05)，B組AOD值大于C組(P＜0.05)。SGNs密度B組、C組高于A組，而B組、C組SGNs密度比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。隨著時間的延長其移植細胞數(shù)量減少，術(shù)后42d耳蝸內(nèi)未見明顯移植細胞。
　　 結(jié)論 BDNF-BMSCs在耳蝸內(nèi)能轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細胞，并存活28～42d