CNTF基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)視神經(jīng)鉗夾傷大鼠RGCs的保護(hù)作用.pdf

1、目的：研究經(jīng)慢病毒介導(dǎo)，大鼠睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Ciliary neurotrophic factor，CNTF)基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow derived mesenchymal stemcells，BMSCs)對(duì)SD大鼠視神經(jīng)鉗夾傷(Optic nerve crush，ONC)模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Retinal ganglion cells，RGCs)的保護(hù)作用。
　　方法：
　　1、CNTF-B

2、MSCs的體外構(gòu)建:全基因合成含信號(hào)肽的大鼠CNTF基因編碼序列并克隆至pHIV-dTomato慢病毒載體質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒CNTF-dTomato。CNTF-dTomato/pHIV-dTomato與慢病毒輔助質(zhì)粒psPAX2及pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，獲得重組慢病毒CNTF-lenti及control-lenti。以CNTF-lenti/control-lenti感染SD大鼠BMSCs，構(gòu)建CNTF-BMSCs及

3、空載-BMSCs細(xì)胞，根據(jù)紅色熒光蛋白dTomato表達(dá)情況確定病毒感染效率;未感染lenti的BMSCs為空白-BMSCs。ELISA法測(cè)定空白-BMSCs、空載-BMSCs及CNTF-BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)液中CNTF的質(zhì)量濃度。將CNTF-BMSCs向成骨和成脂方向誘導(dǎo)分化，以茜素紅染色和油紅-O染色對(duì)分化細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　2、ONC大鼠模型建立及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:60只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（A組）、手術(shù)對(duì)照組（B組

4、）、PBS治療組（C組）、空白-BMSCs治療組（D組）、空載-BMSCs治療組（E組）和CNTF-BMSCs治療組（F組），每組各10只;B～F組均雙眼建立ONC模型，夾傷后立即向C～F組大鼠玻璃體腔內(nèi)注射相應(yīng)液體各10μL。
　　3、玻璃體腔注射CNTF-BMSCs對(duì)ONC作用的觀察:損傷后第14d處死各組大鼠，摘除雙眼眼球。石蠟切片HE染色法觀察大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)變化，計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)層細(xì)胞數(shù)。免疫熒光染色檢測(cè)CNTF蛋白在視網(wǎng)膜

5、的定位和表達(dá)情況。Westernblot法檢測(cè)視網(wǎng)膜內(nèi)Caspase-3和Brn3a蛋白的表達(dá)，照片掃描后采用Image J軟件處理，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)率。
　　結(jié)果：
　　1、CNTF-BMSCs構(gòu)建成功:質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示CNTF-dTomato質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組慢病毒對(duì)BMSCs的感染率達(dá)95％。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，感染后第1、2、3、7d，CNTF-BMSCs組細(xì)胞上清液中CNTF蛋白的質(zhì)量濃度明顯高于空白-BMS

6、Cs組及空載-BMSCs組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均=0.000）;CNTF-BMSCs組感染后2、3、7d細(xì)胞上清液中CNTF質(zhì)量濃度均明顯高于感染后1d，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.013，0.004，0.042）。CNTF-BMSCs經(jīng)成脂培養(yǎng)基誘導(dǎo)后分化的細(xì)胞油紅-O染色呈紅色染色，經(jīng)成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)后分化的細(xì)胞茜素紅染色可見(jiàn)橘紅染色。
　　2、成功建立ONC大鼠模型:HE染色結(jié)果顯示，夾傷后14dB組、C組大鼠視網(wǎng)膜RGC

7、s大量丟失，空泡化嚴(yán)重，細(xì)胞排列紊亂，顯示ONC模型成功建立。D、E、F組大鼠視網(wǎng)膜RGCs空泡化減輕，細(xì)胞排列較整齊。
　　3、CNTF-BMSCs對(duì)RGCs的保護(hù)作用:節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，夾傷后14dB組、C組大鼠節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)較A組大幅減少，D、E、F組大鼠節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)高于B、C二組（P均＜0.05）。免疫熒光染色結(jié)果顯示，夾傷后14dA組大鼠視網(wǎng)膜各層均無(wú)CNTF表達(dá)，F(xiàn)組視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層CNTF大量表達(dá)，其他各組視