DDR2基因缺失對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性影響的研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)是現(xiàn)階段研究廣泛的一種重要的成體干細(xì)胞。因其具有良好的生長、分化能力以及向多種細(xì)胞分化的潛能，成為研究骨再生工程中重要的種子細(xì)胞，它對骨組織缺損的修復(fù)有著良好的效果。但是BMSCs向成骨細(xì)胞分化并修復(fù)骨組織缺損是一個復(fù)雜的過程，是由許多細(xì)胞外因子共同作用產(chǎn)生的結(jié)果。近年來的研究證實DDR2（Discoidin Domain Receptor2）作為I型

2、膠原的特異性受體，在成骨細(xì)胞的分化中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。而對于其在BMSCs向成骨細(xì)胞的分化過程中所起到的作用還鮮有研究，對其作用機理尚不明確。本實驗通過DDR2基因缺失小鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定，初步探索DDR2基因缺失對小鼠BMSCs成骨分化能力的影響，為進(jìn)一步研究BMSCs的成骨分化能力奠定理論基礎(chǔ)。
　　研究內(nèi)容與方法：
　　1. DDR2基因缺失小鼠BMSCs細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。
　　2. DDR2

3、對于BMSCs細(xì)胞特異性分化特性的影響作用。
　　3. DDR2基因缺失對于BMSCs增殖、凋亡、分化的調(diào)控作用。
　　4.DDR2基因缺失對于BMSCs成骨能力的影響。
　　5. DDR2基因缺失對BMSCs在動物體內(nèi)骨組織修復(fù)能力的影響。
　　我們采用了利用改良型全骨髓貼壁法分離培養(yǎng) DD R2基因缺失小鼠及野生型小鼠的BMSCs，觀察對比兩種細(xì)胞形態(tài)；流式細(xì)胞技術(shù)檢測兩種細(xì)胞表面標(biāo)記分子的表達(dá)；MTT分析檢

4、測細(xì)胞生長周期;流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，將兩種細(xì)胞進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)后，real time-PCR檢測兩種BMSCs成骨誘導(dǎo)3,7,14天后，其成骨相關(guān)基因的表達(dá)量變化；以及對成骨分化相關(guān)蛋白的檢測；包括 ALP、茜素紅染色及O C N、ALP蛋白定量檢測。
　　最后采用小鼠顱骨缺損的模型，將BMSCs與支架材料HA/TCP復(fù)合后植入骨缺損區(qū)，在成骨6周后進(jìn)行MicroCT掃描及HE染色，觀察DDR2基因缺失對小鼠成骨能力的

5、影響
　　研究結(jié)果與結(jié)論：
　　1．成功分離培養(yǎng)出 DDR2基因缺失小鼠的 BMSCs，其生長狀態(tài)與正常野生小鼠的BMSCs相同，外形均呈長梭形，可見細(xì)胞成旋渦狀緊密排列生長，其表面標(biāo)記物的表達(dá)符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特點，細(xì)胞具有體外誘導(dǎo)成骨與成脂分化的能力，證明培養(yǎng)的細(xì)胞是BMSCs。
　　2.DDR2基因缺失后，對BMSCs的凋亡略有抑制作用，但并不影響其正常的生長與傳代。
　　3.體外對兩種 BMSCs進(jìn)行成骨

6、和成脂誘導(dǎo)分化后發(fā)現(xiàn)，DDR2基因缺失后，BMSCs的成骨分化能力明顯減弱，對其成脂分化能力略有減弱。
　　4.兩種BMSC s經(jīng)成骨誘導(dǎo)以后，發(fā)現(xiàn)DDR2基因缺失后BMSCs的堿性磷酸酶活性降低，OCN分泌減少，對其成骨相關(guān)基因的表達(dá)量有明顯的抑制作用。
　　5.體內(nèi)實驗證實了DDR2基因缺失的BMSCs的骨修復(fù)能力明顯低于正常野生型小鼠的BMSCs。
　　本研究結(jié)果證實DDR2基因缺失后，對于BMSCs細(xì)胞形態(tài)特征