仿生脈沖電磁場對骨髓間充質(zhì)干細胞生物學特性影響的實驗研究.pdf

1、目的：鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMMSC)；通過檢測仿生脈沖電磁場(BPEMF)對BMMSC成骨、成脂肪細胞分化相關(guān)基因表達影響，研究其促進成骨及抑制成脂肪分化的效應(yīng)；在對BMMSC施加電磁場的基礎(chǔ)上加用鈣通道阻滯劑維拉帕米，檢測胞內(nèi)cAMP水平的變化，探討第二信使對BMMSC的生物學特性的影響，并初步探討其機制。
　　 方法：選擇體重為80-120g的wistar大鼠，雌雄不限，應(yīng)用密度梯度離心+貼壁篩選法提取BMMSC，當

2、細胞培養(yǎng)至第三代，用于實驗。實驗分為三組，空白對照組(A)、BPEMF組(B)、BPEMF+維拉帕米組(C)。應(yīng)用MTT測定BPEMF刺激早期(3-9d)及后期(11-15d)細胞增殖情況；應(yīng)用real time PCR方法測定BMMSC成骨細胞分化關(guān)鍵基因核心結(jié)合因子(RUNX2)的表達；應(yīng)用RT-PCR測定BMMSC成脂肪分化基因過氧化物酶增殖因子激活物受體-γ(PPAR-γ)及調(diào)節(jié)成骨-破骨平衡相關(guān)基因骨保護蛋白(OPG)及核因子

3、KB受體活化因子配基(rankle)的表達；應(yīng)用Elisa測定BMMSC胞內(nèi)cAMP、堿性磷酸酶(ALP)水平的變化。
　　 結(jié)果：提取的細胞呈梭形或多角形，折光性良好。在成骨誘導(dǎo)三周后茜素紅染色可見鈣結(jié)節(jié)形成，成脂肪誘導(dǎo)兩周后油紅O染色可見多量脂滴形成，符合BMMSC多向分化的特性；MTT結(jié)果顯示：BPEMF(B)組相比空白對照(A)組對BMMSC在早期有促進增殖的作用，在晚期促進增殖的作用減弱，BPEMF+維拉帕米組(C)組

4、一定程度上抑制細胞增殖；real time PCR顯示B、C組比A組成骨分化關(guān)鍵基因RUNX2表達明顯上調(diào)；RT-PCR顯示B、C組比A組成脂肪分化相關(guān)基因PPAR-γ2表達下調(diào)，骨保護素基因表達明顯上調(diào)，RANKL基因表達影響并不明顯；Elisa顯示ALP、cAMP表達明顯上調(diào)。
　　 結(jié)論：BPEMF對BMMSC在刺激早期有促進增殖的作用，這種作用是Ca2+升高的結(jié)果并會隨著刺激的進行而減弱；BEMF會刺激cAMP升高，cA