電磁場(chǎng)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及初步機(jī)制.pdf

1、目的：（1）體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。（2）通過(guò)檢測(cè)電磁場(chǎng)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化指標(biāo)的影響，研究電磁場(chǎng)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化的效應(yīng)。（3）研究電磁場(chǎng)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成脂肪分化影響。（4）研究電磁場(chǎng)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞信號(hào)通路的影響，并探討電磁場(chǎng)激活的信號(hào)通路同電磁場(chǎng)促成骨效應(yīng)間的聯(lián)系。
　　 方 法：用梯度離心+反復(fù)貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)和純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，取純度較高且活性良好的P4-P6代細(xì)胞

2、作為我們研究的靶細(xì)胞。
　　 （1）采用多向分化誘導(dǎo)和流式細(xì)胞檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物等方法對(duì)所取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，以確定所取細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 （2）通過(guò)PNPP法檢測(cè)堿性磷酸酶活性，RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多種成骨指標(biāo)：ALP、RUNX2、BMP2、BSP、DLX5的表達(dá)，免疫組化檢測(cè)I型膠原的表達(dá)，Von Kossa染色法檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)的形成等方法探討電磁場(chǎng)促進(jìn)骨髓間充

3、質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的效應(yīng)。
　　 （3）通過(guò)RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)成脂肪指標(biāo)的表達(dá)、western blot 檢測(cè)PPARγ蛋白的表達(dá)，油紅O染色檢測(cè)脂肪滴的形成，檢測(cè)電磁場(chǎng)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂肪分化的影響。
　　 （4）通過(guò)Western Blot、ELISA等方法檢測(cè)電磁場(chǎng)對(duì)MAPK、AKT、cAMP-PKA等信號(hào)通路的影響，找出相關(guān)激活的信號(hào)通路及作用位點(diǎn)。
　　 （5）通過(guò)加入信號(hào)通路抑制劑或激

4、動(dòng)劑，檢測(cè)在抑制或活化信號(hào)通路的條件下電磁場(chǎng)促成骨效應(yīng)的變化，探討電磁場(chǎng)激活的信號(hào)通路同其促成骨效應(yīng)間的聯(lián)系。
　　 結(jié) 果：（1）所取細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察呈成梭形或多角形，有較好的折光性；生長(zhǎng)迅速，常成簇狀，集落狀生長(zhǎng)。在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基作用下21天后可形成大量鈣結(jié)節(jié)，在成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基作用下14天后有大量脂肪滴的形成。流式鑒定結(jié)果顯示，CD90+，CD45-；CD29+, CD45-的表達(dá)率均在95％以上，而CD45+陽(yáng)性的

5、表達(dá)率小于5％，這表明其基本不含造血細(xì)胞系，細(xì)胞均一性良好，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物特征。
　　 （2）電磁場(chǎng)作用三天后明顯促進(jìn)堿性磷酸酶活性的表達(dá)，促進(jìn)I型膠原的表達(dá)，多種成骨指標(biāo)：ALP、BMP2、DLX5、BSP、RUNX2等mRNA的表達(dá)在電磁場(chǎng)作用三天后表達(dá)明顯升高。在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，15天和21天鈣結(jié)節(jié)染色電磁場(chǎng)作用組較對(duì)照組鈣結(jié)節(jié)數(shù)目明顯增多。
　　 （3）RT-PCR及實(shí)時(shí)定向PCR顯示電磁

6、場(chǎng)作用下，成脂肪分化指標(biāo)PPAR-γ2、adipsin、AP2等mRNA下調(diào)；PPAR-γ2蛋白表達(dá)下調(diào)；脂肪滴的形成減少。
　　 （4）電磁場(chǎng)作用細(xì)胞15min、30min、60min、120min后檢測(cè)cAMP、PKA、ERK1/2、P38、JNK、AKT等信號(hào)通路位點(diǎn)，結(jié)果顯示電磁場(chǎng)增加cAMP和PKA的表達(dá)；促進(jìn)磷酸化ERK1/2和P38的表達(dá)；而對(duì)JNK和AKT等磷酸化表達(dá)沒(méi)有影響。加入PKA抑制劑H-89及ERK1/

7、2抑制劑PD98059后，檢測(cè)電磁場(chǎng)促成骨指標(biāo)表達(dá)變化，顯示加入通路抑制劑抑制電磁場(chǎng)激活的信號(hào)通路將明顯抑制電磁場(chǎng)的促成骨效應(yīng)。
　　 結(jié) 論：
　　 （1）通過(guò)梯度離心法+反復(fù)貼壁分離法可獲得純度較高的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 （2）電磁場(chǎng)可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化。
　　 （3）電磁場(chǎng)抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成脂肪細(xì)胞分化。
　　 （4）電磁場(chǎng)激活骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)cAMP-PKA信號(hào)通