小檗堿對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響及機(jī)制探討.pdf

1、[目的]
　　 1.通過流式細(xì)胞儀對分離純化的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，為實驗提供合格的細(xì)胞來源。
　　 2.觀察不同濃度小檗堿對體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響，以評價其能否促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，并探討其作用機(jī)制。
　　 3.進(jìn)一步觀察不同濃度小檗堿對小鼠前成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)成骨分化的影響，探討其對前成骨細(xì)胞分化的影響。
　　 [方法]
　　 1.運(yùn)用全骨髓貼壁2

2、4h半量換液法分離培養(yǎng)BMSCs；倒置相差顯微鏡逐日觀察原代及傳代細(xì)胞的生長、增殖及形態(tài)特征；取生長狀態(tài)良好的第四代細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原。
　　 2.實驗分為空白組、成骨誘導(dǎo)組(化學(xué)誘導(dǎo)法：1×10-8mol·L-1地塞米松+10mmol·L-1β-磷酸甘油+100 mol·L-1抗壞血酸)、陽性藥物對照組(1×10-6mol·L-1淫羊藿苷+成骨誘導(dǎo)液)和藥物組(1×10-5 mol·L-1小檗堿+成骨誘導(dǎo)組、

3、1×10-6mol·L-1小檗堿+成骨誘導(dǎo)組，1×10-7mol·L-1小檗堿+成骨誘導(dǎo)組)。采用MTT法測定不同濃度小檗堿對BMSCs增殖的影響；采用鈣鈷法對胞漿中堿性磷酸酶進(jìn)行染色；采用對硝基苯磷酸二鈉法測定細(xì)胞裂解液中堿性磷酸酶活性；采用免疫放射法測定培養(yǎng)液中骨鈣素水平；采用等離子體-直讀光譜儀測定細(xì)胞鈣化程度，茜素紅染色法顯示鈣結(jié)節(jié)；采用RT-PCR法檢測各藥物組骨向分化過程中Runx2基因和DKK1基因的表達(dá)，闡釋其促BMSC

4、s骨向分化可能的作用機(jī)制。
　　 3.實驗分為空白組、陽性藥物對照組(1×10-6mol·L-1淫羊藿苷組)和藥物組(1×10-6mol·L-1小檗堿組)。采用MTT法檢測不同濃度干預(yù)藥物對MC3T3-E1增殖的影響；采用對硝基苯磷酸二鈉法測定細(xì)胞裂解液中ALP活性；采用等離子體-直讀光譜儀測定檢測細(xì)胞鈣化程度。
　　 [結(jié)果]
　　 1.倒置顯微鏡下觀察，傳4代后可獲得均一性較高的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢

5、測P4代BMSCs表面標(biāo)志抗原CD29、CD90表達(dá)陽性，陽性率為98％。CD45表達(dá)陰性，陰性率為99.2％。
　　 2.小檗堿在1×10-9～1×10-5mol·L-1濃度范圍對BMSCs增殖無顯著影響。1×10-7和1×10-6 mol·L-1小檗堿能明顯提高BMSCs內(nèi)堿性磷酸酶活性。1×10-7～1×10-5mol·L-1小檗堿能明顯促進(jìn)BMSCs骨鈣素合成和分泌。小檗堿在濃度為1×10-6和1×10-5mol·L-1

6、小檗堿可增加BMSCs鈣鹽沉積量和鈣化結(jié)節(jié)形成。1×10-6 mol·L-1小檗堿可使Runx2 mRNA表達(dá)上調(diào)和Dkkl mRNA表達(dá)下調(diào)。
　　 3.小檗堿對MC3T3-E1的增殖無顯著影響。1×10-6mol·L-1小檗堿能明顯提高M(jìn)C3T3-E1堿性磷酸酶活性，增加BMSCs鈣鹽沉積量。
　　 [結(jié)論]
　　 1.采用全骨髓貼壁24h半量換液法可獲得穩(wěn)定、均質(zhì)性良好的鼠BMSCs。
　　 2.小