低強(qiáng)度脈沖電磁場對(duì)體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響.pdf

1、20 世紀(jì)70 年代以來，脈沖電磁場（pulsed electromagnetic fields，PEMFs）作為一種非侵入性治療方法被用于骨折延遲愈合、骨不連、骨質(zhì)疏松癥等骨科疾病。電磁場能促進(jìn)活細(xì)胞增殖及分化，刺激骨局部因子的產(chǎn)生，并能改善股骨的骨密度和生物力學(xué)特性。但是電磁場對(duì)骨的作用機(jī)理還不是很清楚，電磁場的頻率、場強(qiáng)、作用時(shí)間以及脈寬波形等對(duì)治療效果也有不同程度的影響。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells

2、, MSCs）是存在于骨髓基質(zhì)系統(tǒng)中的一種組織干細(xì)胞，具有自我更新能力和多向分化潛能，一定的誘導(dǎo)條件下可分化為成骨細(xì)胞。而且成體干細(xì)胞具有注入體內(nèi)后的趨化性特征，較明顯的集中到受損部位，到達(dá)受損傷部位后，在局部微環(huán)境的誘導(dǎo)下，成體干細(xì)胞發(fā)生明顯的誘導(dǎo)分化，使成體干細(xì)胞向損傷組織修復(fù)所急需的組織細(xì)胞分化，從而促進(jìn)損傷組織的修復(fù)。這對(duì)骨科疾病的自體細(xì)胞治療甚至異體細(xì)胞的治療提供了可能性。 本課題主要研究低強(qiáng)度PEMFs 對(duì)體外培養(yǎng)大

3、鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(ratmesenchymal stem cells, rMSCs) 增殖及向成骨細(xì)胞分化的影響。應(yīng)用MTT法、ALP 測定、四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記、鈣結(jié)節(jié)染色法測定MSCs 增殖及向成骨細(xì)胞分化后的體外骨形成情況。初步探討了頻率和強(qiáng)度對(duì)rMSCs 增殖和成骨分化的影響。為臨床應(yīng)用PEMFs 治療骨折、骨不連、骨質(zhì)疏松癥等骨科疾病提供了新的思路與方法。 主要工作概括如下： 1、rMSCs 的原代培養(yǎng) 目

4、的：探討rMSCs 簡單有效的體外原代培養(yǎng)方法。 方法：用全骨髓貼壁法分離rMSCs，差速黏附法進(jìn)行純化，繪制原代及生長良好的第3 代細(xì)胞的生長曲線，進(jìn)行PAS-過碘酸雪夫氏染色、油紅-O 染色和堿性磷酸酶（ALP）染色。 結(jié)果：細(xì)胞形態(tài)良好，具有MSCs 外觀，生長曲線呈典型的S 型，染色結(jié)果均為陰性，提示細(xì)胞未分泌肝糖元，未向脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞方向分化。 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)采用的方法可以獲得一定量的rMSCs，方法簡

5、單可行，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。 2、PEMFs 對(duì)rMSCs 增殖的影響 目的：探討不同頻率，不同磁場強(qiáng)度的PEMFs對(duì)rMSCs的影響。 方法：用全骨髓貼壁法分離rMSCs，對(duì)生長良好的第3 代細(xì)胞進(jìn)行15Hz ，0.2mT；15Hz ，0.4mT；15Hz ，0.8mT；1Hz，0.2mT； 1Hz，0.4mT； 1Hz，0.8mT的PEMFs刺激，MTT法測定細(xì)胞增殖水平，流式細(xì)胞儀法測定細(xì)胞周期變化

6、。 結(jié)果：rMSCs經(jīng)PEMFs刺激5d（1 次/1d，每次3h）后，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖水平和（S+G2/M）期細(xì)胞數(shù)量均有不同程度提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 其中MTT水平以1Hz，0.4mT組變化最為明顯（3d，0.323±0.051；5d，0.714±0.058），和對(duì)照組相比（3d，0.246±0.044；5d，0.487±0.064），差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；細(xì)胞周期變化也以1Hz，0.4

7、mT組變化最為明顯（G0/G1：75.3±0.17，S：8.5±0.12，G2/M：16.4±0.20，PI：24.9），相對(duì)于對(duì)照組（G0/G1：83.3±0.33，S：7.0±0.29，G2/M：9.8±0.23，PI：16.8），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論：rMSCs經(jīng)PEMFs場刺激后，能促進(jìn)體外培養(yǎng)該細(xì)胞的增殖水平，磁場參數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響，以1Hz，0.4mT的PEMFs效果最佳。 3、PEM

8、Fs 對(duì)rMSCs 成骨分化的影響 目的：探討PEMFs 刺激對(duì)rMSCs 向成骨細(xì)胞分化的影響。 方法：用全骨髓貼壁法分離rMSCs，經(jīng)差速黏附法篩選，對(duì)生長良好的第3 代細(xì)胞進(jìn)行頻率1Hz 、磁感應(yīng)強(qiáng)度0.4mT 的PEMFs 刺激，檢測堿性磷酸酶活性，進(jìn)行四環(huán)素?zé)晒馊旧外}結(jié)節(jié)染色。 結(jié)果：rMSCs 經(jīng)PEMFs 刺激（1 次/1d，每次3h）后，實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）