嗅鞘細胞移植治療大鼠馬尾神經(jīng)壓迫損傷的初步研究.pdf

1、終絲及脊髓圓錐以下的神經(jīng)根構成了馬尾神經(jīng)(cauda equina，CE)，其主要功能包括傳導會陰部、馬鞍區(qū)的感覺，控制大小便功能及踝、膝或球海綿體反射，一旦損傷，患者可以出現(xiàn)下腰痛、坐骨神經(jīng)痛以及鞍區(qū)感覺減退或缺失、排便障礙及性功能障礙等為主要表現(xiàn)的臨床癥候群。Mixter等在1934年首次報道，并將其命名為馬尾神經(jīng)綜合征(cauda equina syndrome，CES)。大部分腰椎退變、腰椎管狹窄、腰椎間盤突出患者都可以先嘗試保

2、守治療，如果癥狀未見緩解或繼續(xù)加重而出現(xiàn)不可耐受的根性痛或運動、感覺功能障礙后，才會進行擇期手術治療，而且大部分患者術后恢復令人滿意。而CES卻不同，一旦發(fā)病，要求進行急診手術，否則一旦出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷，很難完全恢復。目前馬尾神經(jīng)綜合征的發(fā)病機制尚不完全清楚，可能是由于神經(jīng)受到機械性壓迫、炎癥、靜脈充血或缺血等原因導致病變。由于手術減壓后病人的癥狀改善并不確定，因此進一步研究馬尾神經(jīng)損傷的機制及非手術治療方法顯得非常必要。
　　

3、 近年來，嗅鞘細胞（Olfactory ensheathing cells，OECs）移植被認為是治療神經(jīng)系統(tǒng)修復過程的最有前景的方法之一。嗅鞘細胞位于嗅覺系統(tǒng)，是一類獨特的神經(jīng)膠質細胞。它同時存在于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并兼具雪旺細胞和星型膠質細胞的特點。在生理狀態(tài)下，嗅神經(jīng)因與外界接觸而易受損傷，因此其終身都在進行更新，在整個過程中，嗅鞘細胞始終包繞著嗅神經(jīng)軸突，形成神經(jīng)束，引從嗅上皮（olfactoryepithelium，OE）新

4、生的軸突長入位于中樞的嗅球(olfactory bulb，OB)。嗅鞘細胞具有促進嗅神經(jīng)軸突生長及再生的能力，同時也具有引導其生長的能力，這一特征被成功地應用于脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)的治療。大量研究表明，移植到中樞神經(jīng)損傷處的嗅鞘細胞能形成引導神經(jīng)突起生長通道，再生的神經(jīng)軸突可以沿著這一通道向遠處延伸，使中樞神經(jīng)損傷得以修復。移植神經(jīng)營養(yǎng)因子基因修飾的嗅鞘細胞可明顯促進全脊髓橫斷大鼠皮質脊髓束再生。但目

5、前未見移植嗅鞘細胞治療馬尾神經(jīng)損傷的相關報道。
　　 早期的研究表明馬尾神經(jīng)損害導致背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)內神經(jīng)元壞死和脊髓后角細胞壞死，采用腦源性神經(jīng)生長因子(Basic fibroblast growthfactor，BDNF)能夠促進輕、中度損害的馬尾神經(jīng)功能恢復，但對于重度損傷的情況效果不理想。嗅鞘細胞的移植是否能夠促進馬尾神經(jīng)功能恢復，是否對不同程度損害的馬尾神經(jīng)功能恢復都有改善

6、作用以及嗅鞘細胞移植入體內后是否能達到功能性整合，使損傷的神經(jīng)結構重建，實現(xiàn)損傷髓鞘的髓鞘化，有待于進一步研究。
　　 研究目的:
　　 通過硅膠條壓迫法建立大鼠馬尾神經(jīng)壓迫損傷模型。通過顯微注射的細胞移植方法向硬膜囊內注射OECs，將其移植到壓迫損傷部位的馬尾神經(jīng)表面，明確OECs移植后在局部的存活時間及大鼠馬尾神經(jīng)MBP表達量及神經(jīng)功能改變情況。
　　 研究方法:
　　 一、采用硅膠條壓迫法成功構建椎

7、管狹窄的大鼠馬尾神經(jīng)壓迫模型。將SD大鼠的腰4節(jié)段咬除椎板上緣，暴露硬膜囊，將10mm×0.8mm×1.0mm的硅膠條置入大鼠L4和L5椎管內，壓迫7天，通過BBB評分、甩尾痛覺檢測實驗，以及免疫組化染色對損傷情況評估。
　　 二、原代OECs的培養(yǎng)。取SD大鼠OB嗅神經(jīng)層OECs進行原代細胞培養(yǎng)，通過差速貼壁及Thy1.1抗體進行細胞純化，通過OECs特異性標記物p75NTR及S100的抗體標記體外培養(yǎng)的原代OECs，鑒定細胞

8、純度。
　　 三、OECs移植。取GFP轉基因大鼠OB進行OECs培養(yǎng)及純化。取符合條件的SD大鼠造模，篩選造模成功的大鼠，進行手術減壓去除壓迫硅膠條后硬膜囊內注射8μl GFP-OECs PBS懸液（濃度約1×105/μl），對照組則注射等量的PBS溶液。
　　 四、GFP-OECs移植后在不同時間點取細胞移植部位CE制成細胞懸液進行流式細胞檢測，觀察樣本GFP熒光強度。
　　 五、細胞移植后在不同時間點提取各

9、組壓迫損傷部位的馬尾神經(jīng)組織總蛋白，通過Western blot觀察MBP表達水平的變化。
　　 六、細胞移植后在不同時間點進行BBB評分和甩尾實驗觀察手術減壓及細胞移植后馬尾神經(jīng)壓迫損傷大鼠的功能變化。
　　 結果:
　　 一、硅膠條壓迫大鼠馬尾神經(jīng)7天后，大鼠BBB評分逐漸穩(wěn)定在11分左右，甩尾潛伏期由損傷前的4-6s逐漸延長至12s左右，MBP免疫組化顯示大鼠馬尾神經(jīng)出現(xiàn)脫髓鞘表現(xiàn)。通過硅膠條壓迫法可以構建

10、穩(wěn)定的大鼠馬尾神經(jīng)壓迫損傷模型。
　　 二、所培養(yǎng)的原代OECs純度達到95％以上，該純度能夠滿足后續(xù)實驗需要。
　　 三、OECs移植后2周時，樣本的GFP熒光強度高于野生型SD大鼠CE細胞懸液，2周后損傷局部組織的細胞懸液GFP熒光與非轉基因大鼠的本底熒光強度無明顯差異，說明外源性OECs可在損傷局部存活約2周時間。
　　 四、OECs移植后MBP的表達水平在移植后的1天、3天沒有顯著變化，而在移植后的2-3

11、周MBP蛋白表達水平與對照組相比有提高，4周后蛋白表達水平趨于穩(wěn)定，提示OECs移植有助于成年大鼠馬尾神經(jīng)損傷后的再髓鞘化。
　　 五、OECs移植后BBB評分結果和甩尾實驗結果表明，所有大鼠在減壓、硬膜囊內注射術后后肢功能逐漸得到一定程度的改善，但是細胞移植組功能恢復并未優(yōu)于假移植組，提示這些功能恢復是由于手術解除馬尾神經(jīng)壓迫后大鼠自身恢復所致。
　　 結論:
　　 OB-OECs可以通過硬膜囊內注射的方法進行

12、移植，并可在損傷局部聚集至少2周的時間。移植組動物的MBP表達量在2-3周時高于對照組，說明，OECs移植后可能通過細胞間的相互作用，如分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、激活SCs、清除壞死組織等作用而保護脫髓鞘的馬尾神經(jīng)，使其在后續(xù)的再髓鞘化過程中更快的恢復。但是硬膜囊內直接注射OECs在4周的時間內并未使實驗動物獲得明顯的功能改善。因此，在OECs移植的具體方法，如注射的細胞量、細胞懸液的介質等方面仍需進一步研究，從而使OECs在馬尾神經(jīng)損傷修復中