HDACi對大鼠急性馬尾神經(jīng)壓迫損傷保護作用的實驗研究.pdf

1、背景：
　　馬尾神經(jīng)綜合征(CES)病程發(fā)病急、致殘率高，一直作為腰椎疾病的一大難題難以攻破。馬尾神經(jīng)因其特殊的解剖結(jié)構(gòu)，生理上易受到機械性損傷，并且一旦臨床上出現(xiàn)鞍區(qū)感覺缺失、腸道功能紊亂以及性功能障礙等惡化癥狀后，手術(shù)治療預后效果很差，多數(shù)患者殘留有膀胱或肛門括約肌的功能障礙，給患者及其家屬帶來沉重的精神壓力和經(jīng)濟負擔。目前臨床上采用的藥物對癥治療和手術(shù)方法均未取得良好效果，臨床研究少有突破。因此，尋求一種新的有效治療馬尾神經(jīng)

2、損傷的方法顯得尤為重要。
　　核小體中，組蛋白乙?；?HAT)和組蛋白去乙?；?HDAC)共同調(diào)節(jié)組蛋白的乙?；?，維持組蛋白乙?；€(wěn)態(tài)。由于與基因的轉(zhuǎn)錄、表達、抑制和細胞的增殖、分化關(guān)系密切，HDAC已經(jīng)作為腫瘤靶標在臨床中得到廣泛應用。同時，隨著廣大學者對HADC及HDACi的深入研究發(fā)現(xiàn)，除腫瘤領域外，HDACi對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病也有治療效果。已有研究證實了組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACi)的神經(jīng)保護作用，它影響著

3、突觸活性和神經(jīng)元的功能。但目前關(guān)于HDACi應用于馬尾神經(jīng)損傷的研究尚未見相關(guān)報道。
　　本項研究在以往實驗基礎上構(gòu)建并改進了大鼠馬尾神經(jīng)壓迫損傷的模型;其次將HDACi經(jīng)皮下注入急性馬尾神經(jīng)壓迫損傷的大鼠體內(nèi)，以期恢復組蛋白乙?；腿ヒ阴；g的平衡狀態(tài)，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄障礙，從而達到保護馬尾神經(jīng)功能的目的;最后，應用RNA-seq研究大鼠馬尾神經(jīng)壓迫損傷給予HDACi治療后轉(zhuǎn)錄組基因表達變化，通過分析數(shù)據(jù)，探究其深層次的分子機制，

4、期望從中發(fā)現(xiàn)HDACi對于馬尾神經(jīng)壓迫損傷保護作用的作用靶點。
　　研究目的：
　　建立并改進大鼠馬尾神經(jīng)壓迫損傷的模型;證實HDACi對大鼠急性馬尾神經(jīng)壓迫損傷的保護作用;利用RNA-seq手段研究大鼠馬尾神經(jīng)壓迫損傷給予HDACi治療后轉(zhuǎn)錄組基因表達變化，通過分析數(shù)據(jù)，探究其深層次的分子機制，為進一步研究馬尾神經(jīng)損傷保護修復機制提供實驗基礎，以期在馬尾神經(jīng)綜合征的治療中開拓新的研究方向。
　　研究方法：
　　

5、1、選取20只出生6周左右、體重約250克的實驗SD大鼠，隨機分為3組:模型組，n=8;假手術(shù)組，n=6;對照組，n=6。模型組大鼠在L4處咬除椎骨背脊，用電鉆在咬除部位鉆一1.2mm小孔，鉆透椎板，將一長10.0mm、厚1.1mm、寬1.0mm的硅膠條沿小孔置入椎管遠端，壓迫L5及L6段馬尾神經(jīng)。假手術(shù)組僅在L4椎板上鉆孔，未置入硅膠條。模型建立3天后，運用馬尾神經(jīng)壓迫損傷模型的BBB評分、斜板實驗評分判定各實驗組動物行為學改變。在術(shù)

6、后設置時間點取材，運用HE染色、LFB染色、TUNEL染色、免疫熒光組織染色判定各實驗組動物的組織病理學變化，確定模型建立成功。
　　2、選取30只出生6周左右、體重約250克的實驗SD大鼠，隨機分為3組:實驗組（注入VPA組），n=10;對照組（注入生理鹽水組），n=10;假手術(shù)組，n=10。設計在實驗組和對照組兩組每只大鼠L4椎板上鉆孔，并置入硅膠條，假手術(shù)組僅鉆孔，不置入硅膠條。實驗組術(shù)前2h經(jīng)皮下注入VPA(300mg/k

7、g)，造模后實驗組給予VPA(300g/kg，2/d)，對照組注入等量生理鹽水。在大鼠造模前2h及術(shù)后連續(xù)7d采集大鼠BBB評分、斜板試驗評分。在術(shù)后7d，取大鼠的馬尾神經(jīng)組織進行免疫熒光染色、HE染色和LFB染色，取大鼠的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)組織進行TUNEL染色，取大鼠受損馬尾神經(jīng)近段的脊髓圓錐組織進行TUNEL染色。
　　3、借助于最新的高通量測序技術(shù)，RNA-Seq來檢測實驗組與對照組對應節(jié)段馬尾神經(jīng)組織的基因表達差異，通

8、過分析數(shù)據(jù)，初步找到與HDACi保護馬尾神經(jīng)壓迫損傷作用機制高度相關(guān)的關(guān)鍵分子和信號通路。
　　結(jié)果
　　1、成功地建立并改進大鼠馬尾神經(jīng)壓迫損傷模型。
　　2、本次研究中，檢測動物模型行為學的BBB評分、斜板實驗評分結(jié)果提示，VPA注入后，實驗組的下肢運動功能較對照組有明顯的改善，組織病理學結(jié)果提示，實驗組馬尾神經(jīng)的神經(jīng)纖維華勒變性和脫髓鞘病變明顯減輕，免疫熒光組織染色可以觀察到實驗組較對照組髓鞘化增多。TUNEL染

9、色發(fā)現(xiàn)，實驗組中脊髓前角細胞神經(jīng)元和DRG神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)量明顯減少。
　　3、通過分析大鼠馬尾神經(jīng)壓迫損傷應用HDACi治療后的差異基因表達及初步驗證，篩選出HDAC11，IL18，F(xiàn)GF1，F(xiàn)GF5等差異表達基因，其中HDAC11在VPA作用后存在高表達，IL18在VPA作用后表達下降，F(xiàn)GF1在VPA作用后存在高表達，F(xiàn)GF5在VPA作用后存在表達下降。通過目前通用的KEGG Pathway富集分析，發(fā)現(xiàn)了以下一些高度相關(guān)信

10、號通路:MAPK-JNK、p38MAPK、calcium channel、GRB2-Ras-MAPK-Erk、Neuroactive Ligand-Receptor Interaction。
　　結(jié)論：
　　本實驗所建立的大鼠馬尾神經(jīng)壓迫損傷模型設計合理、方便操作、可復制性強。能夠真實有效地模擬引起馬尾神經(jīng)損傷的臨床常見致病因素-腰椎間盤突出的致病過程。HDACi對大鼠急性馬尾神經(jīng)壓迫損傷起到一定的保護作用，它可以改善馬尾神

11、經(jīng)壓迫損傷后的運動功能障礙、減少神經(jīng)元凋亡、促進神經(jīng)損傷后軸突再生。因此，HDACi是一種具有重大潛力的可配合臨床減壓手術(shù)有效改善患者預后功能的藥物治療措施。通過RNA-seq進行生物信息學分析和初步驗證，結(jié)合KEGG Pathway富集分析，我們篩選出了與HDACi保護馬尾神經(jīng)壓迫損傷的作用機制高度相關(guān)的關(guān)鍵分子及信號通路:HDAC11，IL18，F(xiàn)GF1，F(xiàn)GF5，MAPK-JNK、p38MAPK、calcium chanel、GR