胡椒堿對脊髓損傷大鼠神經(jīng)保護及作用機制實驗研究.pdf

1、背景:脊髓損傷是神經(jīng)外科常見疾病之一,雖經(jīng)國內(nèi)外多年研究,目前尚無理想恢復(fù)神經(jīng)功能的方法。依據(jù)目前對脊髓損傷病理發(fā)展過程的新認(rèn)識及胡椒堿藥理作用的研究,我們設(shè)計本研究以觀察胡椒堿是否具有對脊髓損傷神經(jīng)功能保護作用,并對可能的作用機制做進一步的探討。以求保護脊髓損傷后的神經(jīng)功能的新方法。
　　 第一部分胡椒堿對脊髓損傷大鼠運動功能保護作用的觀察
　　 目的:觀察胡椒堿是否具有對脊髓損傷大鼠運動功能保護作用。
　　

2、方法:(1)動物來源與分組:將36只成年雄性SD大鼠應(yīng)用隨機數(shù)字表進行隨機分組,分為4組,每組9只,分為假手術(shù)組,生理鹽水組,胡椒堿溶媒組,胡椒堿組。(2)大鼠脊髓損傷動物模型制作:所有組的大鼠均在胸10左右水平打開背側(cè)脊柱棘突,生理鹽水組,胡椒堿溶媒組,胡椒堿組按照Allen's法建立脊髓損傷模型,假手術(shù)組不進行脊髓損傷。(3)給藥方式:胡椒堿組大鼠進行50mg/kg胡椒堿懸濁液(含7ml/kg胡椒堿溶媒)灌胃給藥,胡椒堿溶媒組大鼠只

3、給予7ml/kg胡椒堿溶媒(含滅菌注射用水、無水乙醇和聚乙二醇-400混合液)灌胃給藥,假手術(shù)組和生理鹽水組大鼠給予7ml/kg生理鹽水灌胃給藥。每組大鼠都是在術(shù)后1d給予灌胃給藥,每天一次,持續(xù)14d。(4)大鼠脊髓神經(jīng)功能測定:受試大鼠分別在術(shù)后1d、7d、14d應(yīng)用國際通用的BBB行為學(xué)評分法(Basso-Beattie-BresnahanTest)進行評價。模型各組術(shù)后1d評分為0分則納入實驗。在7d和14d時進行各組進行比較。

4、術(shù)后14d受試動物麻醉后經(jīng)左心室灌注4％多聚甲醛磷酸緩沖液,取損傷部位5mm脊髓,用4%多聚甲醛液固定48小時,常規(guī)石蠟包埋。(5)數(shù)據(jù)統(tǒng)計:本實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)均為統(tǒng)計計量資料,符合正態(tài)的數(shù)據(jù)用-x±S(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,否則用中位數(shù)表示。多個樣本均數(shù)比較,若數(shù)據(jù)符合正態(tài)性分布且方差齊則采用one-way ANOVA(F檢驗),組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,否則采用秩轉(zhuǎn)換的非參數(shù)檢驗的Mann-Whitne

5、y U法。定P＜0.05為有顯著性差異。
　　 結(jié)果:
　　 1術(shù)后1d假手術(shù)組大鼠術(shù)后沒有截癱(21分),術(shù)后7d、術(shù)后14d的評分分別為(21,21)。術(shù)后1d其他組大鼠術(shù)后均出現(xiàn)截癱(0分),胡椒堿組大鼠術(shù)后7d、14d的評分分別為(6.33±1.58,11.00±0.87)。胡椒堿溶媒組大鼠術(shù)后7d、14d的評分分別為(2.89±0.78,6.78±1.09)。生理鹽水組大鼠術(shù)后7d、14d的評分分別為(3.00

6、±1.32,6.44±1.24)。除了假手術(shù)組,其它各組術(shù)后14天較7天評分均有所恢復(fù)。
　　 2術(shù)后7d,假手術(shù)組的評分分別與胡椒堿組(Z=-3.841,P=0.000)、胡椒堿溶媒組(Z=-3.855,P=0.000)和生理鹽水組(Z=-3.839,P=0.000)比較均有顯著性差異。術(shù)后14d,假手術(shù)組的評分分別與胡椒堿組(Z=-3.848,P=0.000)、胡椒堿溶媒組(Z=-3.841,P=0.000)和生理鹽水組(Z

7、=-3.848,P=0.000)比較均有顯著性差異。術(shù)后7d以及術(shù)后14d胡椒堿溶媒組和生理鹽水組之間比較均沒有顯著性差異(Z=-0.184 P=0.854,Z=-0.509 P=0.611),術(shù)后7d胡椒堿組分別與胡椒堿溶媒組和生理鹽水組之間比較有顯著性的差異(Z=-3.485 P=0.000,Z=-3.621 P=0.000),術(shù)后14d胡椒堿組分別與胡椒堿溶媒組和生理鹽水組之間比較有顯著性的差異(Z=-3.621 P=0.000,

8、Z=-3.616.P=0.000)。
　　 結(jié)論:胡椒堿具有促進脊髓損傷大鼠運動神經(jīng)功能恢復(fù)的藥理作用。
　　 第二部分胡椒堿促進脊髓損傷大鼠運動神經(jīng)功能恢復(fù)作用機理研究
　　 目的:探討胡椒堿促進脊髓損傷大鼠運動神經(jīng)功能恢復(fù)作用機理。
　　 方法:(1)動物來源與分組、大鼠脊髓損傷動物模型制作、給藥方式、大鼠脊髓神經(jīng)功能測定和數(shù)據(jù)統(tǒng)計同第一部分。于術(shù)后7d留取脊髓損傷部位標(biāo)本(同第一部分)。模型各組術(shù)后

9、1d評分為0分則納入實驗。術(shù)后7d脊髓組織和術(shù)后14d脊髓組織(第一部分留取)分別行HE染色以觀察脊髓損傷后的病理變化,原位末端標(biāo)記法(TUNEL染色)檢測脊髓神經(jīng)細胞凋亡變化,免疫組織化學(xué)染色法檢測caspase-3蛋白表達變化。
　　 結(jié)果:
　　 1 HE染色觀察脊髓組織病理改變
　　 假手術(shù)組脊髓組織完整,細胞排列整齊,未見明顯壞死及空洞。生理鹽水組、胡椒堿溶媒組和胡椒堿組中,術(shù)后7d各組均有不同程度的組

10、織破壞,并有出血、水腫和空洞。胡椒堿組脊髓組織較連續(xù)。術(shù)后14d各組明顯恢復(fù),胡椒堿組分別與生理鹽水組和胡椒堿溶媒組比較,組織較連續(xù),水腫明顯減輕,僅有輕度的空泡樣變化。
　　 2 TUNEL法測凋亡細胞
　　 2.1 TUNEL法染色陽性的細胞在大鼠脊髓損傷嚴(yán)重的區(qū)域表達較多。假手術(shù)組術(shù)后7d、14d的脊髓組織中表達極少的陽性細胞,分別為(7.54±2.51,6.27±2.27)個,胡椒堿組、胡椒堿溶媒組和生理鹽水組中

11、術(shù)后7d分別為(29.80±6.30,42.58±10.46,41.50±7.97)個,術(shù)后14d分別為(20.32±6.64,30.71±7.10,33.59±6.04)個。
　　 2.2術(shù)后7d,假手術(shù)組的陽性細胞數(shù)分別與胡椒堿組(Z=-3.576,P=0.000)、胡椒堿溶媒組(Z=-3.576,P=0.000)和生理鹽水組(Z=-3.576,P=0.000)比較均有顯著性差異。術(shù)后14d,假手術(shù)組的評分分別與胡椒堿組(Z

12、=-3.576,P=0.000)、胡椒堿溶媒組(Z=-3.576,P=0.000)和生理鹽水組(Z=-3.576,P=0.000)比較均有顯著性差異。生理鹽水組與胡椒堿溶媒組術(shù)后7d、14d比較均無顯著性差異(Z=-0.486,P=0.627,Z=-0.927,P=0.354)。胡椒堿組中凋亡陽性細胞數(shù)分別與胡椒堿溶媒組和生理鹽水組比較,術(shù)后7d有顯著性差異(Z=-2.517,P=0.012,Z=-2.958,P=0.003),術(shù)后14

13、d有顯著性差異(Z=-2.693,P=0.007 Z=-3.223,P=0.001)。
　　 3 Caspase-3陽性表達觀察
　　 3.1在大鼠的脊髓損傷的區(qū)域Caspase-3蛋白陽性表達較多。假手術(shù)組的術(shù)后7d、14d的脊髓組織中極少發(fā)現(xiàn)Caspase-3蛋白陽性表達,平均光度值分別為(0.1323±0.0149,0.1371±0.0122),胡椒堿組、胡椒堿溶媒組和生理鹽水組中術(shù)后7d平均光度值分別為(0.28

14、24±0.0464,0.3452±0.0497,0.3411±0.0449),術(shù)后14d分別為(0.1936±0.0378,0.2551±0.0367,02456±0.0262)。
　　 3.2術(shù)后7d,假手術(shù)組的平均光度值分別與胡椒堿組(P=0.000)、胡椒堿溶媒N(P=0.000)和生理鹽水組(P=0.000)比較均有顯著性差異。術(shù)后14d,假手術(shù)組的評分分別與胡椒堿組(P=0.000)、胡椒堿溶媒組(P=0.000)和生

15、理鹽水組(P=0.000)比較均有顯著性差異。生理鹽水組與胡椒堿溶媒組術(shù)后7d、14d比較均無顯著性差異(P=0.835,P=0.505)。胡椒堿組分別與胡椒堿溶媒組和生理鹽水組比較,術(shù)后7d有顯著性差異(P=0.003,P=0.005),胡椒堿組分別與胡椒堿溶媒組和生理鹽水組比較,術(shù)后14d有顯著性差異(P=0.000,P=0.001)。
　　 結(jié)論:胡椒堿的能夠減少大鼠脊髓損傷部位的神經(jīng)細胞凋亡,其機制可能與抑制大鼠脊髓損傷