高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理對(duì)大鼠脊髓損傷神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)采用SD大鼠為脊髓損傷打擊模型，分組給予高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理，觀察預(yù)處理對(duì)脊髓損傷的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，并對(duì)保護(hù)機(jī)制進(jìn)行初步探討，同時(shí)對(duì)高壓氧治療脊髓損傷的療效給予評(píng)估。本文共分為以下三個(gè)部分內(nèi)容： 一、高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究 目的：通過(guò)建立高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理脊髓損傷動(dòng)物模型，觀察預(yù)處理對(duì)成年大鼠急性脊髓損傷后不同時(shí)期神經(jīng)功能的影響，以探討預(yù)處理對(duì)脊髓損傷后的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。

2、 方法： 1、高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理動(dòng)物模型的建立：成年雌性大鼠隨機(jī)分組后，利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物高壓氧艙和低壓氧艙，在相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件下，分別預(yù)處理5天。 2、脊髓損傷模型的建立：麻醉狀態(tài)下，手術(shù)顯露椎管及硬膜囊，用30g沖擊棒自5cm高度自由落體下墜致傷脊髓。沖擊棒下端直徑3mm，致傷能量為150gcf，建立脊髓損傷模型。 3、觀察項(xiàng)目： (1)行為學(xué)評(píng)價(jià)：采用BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分法，分別在脊髓損傷后1d、1w

3、、2w、4w和8w進(jìn)行評(píng)分。 (2)誘發(fā)電位的測(cè)定：各組大鼠分別在損傷后不同時(shí)期測(cè)定體感誘發(fā)電位和運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位檢測(cè)。 (3)透射電鏡：灌注固定后取損傷區(qū)中心1mm3置入10％戊二醛液，制片，電鏡下觀察采圖。 (4)HE染色光鏡下觀察：各組大鼠分別在損傷后不同時(shí)期灌注固定取材，行脊髓矢狀和冠狀石蠟切片的HE染色觀察。 (5)神經(jīng)束路示蹤：生物素化萄聚糖胺順行示蹤和辣根過(guò)氧化物酶逆行示蹤，觀察上行和下行軸突再

4、生情況，預(yù)處理對(duì)軸突再生的影響。 4、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。 結(jié)果： 1、本實(shí)驗(yàn)高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理及大鼠脊髓打擊傷模型建立可靠穩(wěn)定，具有較好的可重復(fù)性。 2、大鼠脊髓打擊模型在傷后1dBBB評(píng)分為0分，1w為2.86±1.03分，以后逐漸恢復(fù)，8w為14.12±2.15分，經(jīng)高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理后在各時(shí)期與非預(yù)處理?yè)p傷組相比較。 3、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位和體感誘發(fā)電位的潛

5、伏期在脊髓損傷后明顯延長(zhǎng)，在1w-4w各時(shí)期與非預(yù)處理?yè)p傷組相比較，潛伏期縮短，低壓缺氧預(yù)處理組更為明顯，差異有顯著性(p＜0.05)，4w后相對(duì)穩(wěn)定。 4、光鏡及電鏡觀察：脊髓損傷后1d可見(jiàn)，損傷區(qū)中央灰質(zhì)出現(xiàn)大片出血、細(xì)胞腫脹、尼氏體消失，并有大量單核或多核炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；脊髓損傷第1w損傷區(qū)組織出現(xiàn)大片壞死灶，炎性反應(yīng)加?。?w后脊髓損傷及周圍區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，4w損傷脊髓組織出現(xiàn)囊腔樣變化，8w以膠質(zhì)瘢痕為主。

6、結(jié)論： 1、大鼠打擊傷SCI模型與人類SCI有一定相似性，個(gè)體差異不明顯，模型制備簡(jiǎn)單，穩(wěn)定重復(fù)性強(qiáng)。 2、高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理后，大鼠在脊髓損傷后不同時(shí)期脊髓功能改善，運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位和體感誘發(fā)電位潛伏期縮短，病理變化減輕，神經(jīng)束路示蹤標(biāo)志陽(yáng)性纖維明顯增多，提示對(duì)大鼠脊髓損傷均有神經(jīng)保護(hù)作用。 3、高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理對(duì)大鼠脊髓損傷具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。(本實(shí)驗(yàn)建立的是中度脊髓損傷模型)。 4、在本實(shí)

7、驗(yàn)條件下，低壓缺氧預(yù)處理對(duì)脊髓損傷的內(nèi)源性保護(hù)作用較高壓氧預(yù)處理的保護(hù)作用更為顯著。 二、高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制的探討 目的：探討高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，為脊髓損傷的防治提供理論基礎(chǔ)。 方法：預(yù)處理及脊髓打擊傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立分組后，在不同時(shí)期內(nèi)取材，行免疫組織化學(xué)染色，RT-PCR和Westblot(蛋白印跡法)檢測(cè)，觀察預(yù)處理對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞

8、凋亡、神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、軸突生長(zhǎng)抑制因子和嘌呤受體的影響。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。 觀察項(xiàng)目： 1、神經(jīng)細(xì)胞凋亡，TUNEL染色觀察 2、GFAP免疫組織化學(xué)染色觀察 3、Nestin免疫組織化學(xué)染色觀察 4、VEGF免疫組織化學(xué)染色觀察 5、Nogo免役組織化學(xué)染色觀察 6、P2X7嘌呤受體mRNA和蛋白的定量 觀察結(jié)果

9、： 1、非預(yù)處理脊髓損傷1dTUNEL陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多，分布不均勻，灰質(zhì)和白質(zhì)中均可見(jiàn)。 2、GFAP表達(dá)于正常脊髓的中央灰質(zhì)和周圍白質(zhì)。 3、預(yù)處理后1w-4w表達(dá)增加，尤其以低壓缺氧預(yù)處理組更為顯著。 4、非預(yù)處理SCI1dVEGF在大鼠脊髓損傷區(qū)及損傷周邊區(qū)高表達(dá)，主要出現(xiàn)在軟脊膜和脊髓灰、白質(zhì)血管壁上的血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)，脊髓灰、白質(zhì)內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)也出現(xiàn)表達(dá)，。 5、非預(yù)

10、處理SCI后1d，在脊髓損傷區(qū)中央，未見(jiàn)到nogo陽(yáng)性細(xì)胞。2w后，損傷區(qū)附近白質(zhì)，nogo陽(yáng)性免疫細(xì)胞有少量表達(dá)，SCI后8w，見(jiàn)膠質(zhì)瘢痕區(qū)nogo陽(yáng)性表達(dá)反應(yīng)，并且nogo表達(dá)陽(yáng)性區(qū)與膠質(zhì)瘢痕區(qū)相一致。 6、SCI后P2X7受體的表達(dá)變化：在低壓缺氧預(yù)處理組，傷后12h、3d、5d目的條帶幾乎不可見(jiàn)，而高壓氧預(yù)處理組和非預(yù)處理?yè)p傷組卻表現(xiàn)明顯，尤其高壓氧預(yù)處理組在12h表達(dá)更為明顯。傷后7d三組無(wú)明顯差異。 結(jié)論：

11、 1、高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理均可以通過(guò)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡起到神經(jīng)保護(hù)作用。 2、在脊髓損傷的早期(本實(shí)驗(yàn)觀察到為2w之內(nèi))，高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理均可以促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。脊髓損傷后期(本實(shí)驗(yàn)觀察到為4w之后)，高壓氧預(yù)處理有促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增生，增強(qiáng)膠質(zhì)瘢痕形成的可能。 3、脊髓損傷后可以激活神經(jīng)干細(xì)胞或前體細(xì)胞，高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理均可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化，尤其低壓缺氧預(yù)處理更為顯

12、著。 4、脊髓損傷可以導(dǎo)致內(nèi)源性VEGF在脊髓實(shí)質(zhì)中的表達(dá)增強(qiáng)，高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理可以促進(jìn)這一過(guò)程，通過(guò)促進(jìn)血管生成、改善局部微循環(huán)間接地保護(hù)神經(jīng)免受缺血缺氧損傷。 5、脊髓損傷后期(本實(shí)驗(yàn)觀察到為4w之后)，軸突生長(zhǎng)抑制因子nogo的高表達(dá)是影響軸突生長(zhǎng)的重要因素，高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理對(duì)脊髓損傷后nogo表達(dá)的影響不顯著。 6、低壓缺氧預(yù)處理可以在短期內(nèi)通過(guò)抑制P2X7受體的表達(dá)，對(duì)脊髓損傷起到神經(jīng)保護(hù)作

13、用，而高壓氧預(yù)處理則不能，是通過(guò)其他途徑起到神經(jīng)保護(hù)作用的。 三、高壓氧治療實(shí)驗(yàn)性大鼠脊髓損傷的療效評(píng)價(jià) 目的：通過(guò)分組高壓氧治療，評(píng)估治療效果，為脊髓損傷的治療提供依據(jù)。 方法： 1、實(shí)驗(yàn)大鼠分為四組：非預(yù)處理?yè)p傷組、非預(yù)處理?yè)p傷后高壓氧治療組、高壓氧預(yù)處理后的高壓氧治療組和低壓缺氧預(yù)處理后的高壓氧治療組，立即分別給予高壓氧治療2周。 2、觀察項(xiàng)目： (1)行為學(xué)評(píng)價(jià)：采用BBB運(yùn)動(dòng)功能

14、評(píng)分法，分別在治療后1w、2w、4w和8w進(jìn)行評(píng)分。 (2)誘發(fā)電位的測(cè)定：各組大鼠分別在治療后不同時(shí)期進(jìn)行體感誘發(fā)電位和運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位檢測(cè)。 (3)透射電鏡：灌注固定后取損傷區(qū)中心1mm3置入10％戊二醛液，制片，電鏡下觀察采圖。 (4)HE染色光鏡下觀察：各組大鼠分別在治療后不同時(shí)期灌注固定取材，行脊髓石蠟切片的HE染色觀察。 (5)免疫組織化學(xué)染色：觀察高壓氧治療后nestin和GFAP的表達(dá)變化。

15、 (6)神經(jīng)束路示蹤：生物素化萄聚糖胺(BDA)順行示蹤觀察下行軸突再生情況，觀察高壓氧治療對(duì)軸突再生的影響。 3、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。 結(jié)果： 1、經(jīng)高壓氧治療后各組在各時(shí)期與非預(yù)處理?yè)p傷組相比較，評(píng)分明顯增高，非預(yù)處理?yè)p傷組SCI后1w為2.86±1.03分，8w為14.12±2.15分，而低壓缺氧預(yù)處理后高壓氧治療組1w為5.38±1.22分，8w為18.18±1.72分

16、，差異最為明顯(p＜0.01)。 2、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位和體感誘發(fā)電位的潛伏期在脊髓損傷后明顯延長(zhǎng)，經(jīng)高壓氧治療后各組在各時(shí)期與非預(yù)處理?yè)p傷組相比較，潛伏期縮短，低壓缺氧預(yù)處理后高壓氧治療組更為明顯，差異有顯著性。 3、經(jīng)高壓氧治療后各組在各時(shí)期與非預(yù)處理?yè)p傷組相比較病理變化減輕，尤其在損傷區(qū)周圍更為明顯。 4、經(jīng)高壓氧治療后各組GFAP和nestin表達(dá)增加，2w-4w較非預(yù)處理?yè)p傷組差異顯著，低壓缺氧預(yù)處理后高壓氧