神經(jīng)干細胞與嗅鞘細胞共移植治療創(chuàng)傷性腦損傷的實驗研究.pdf

1、本文對神經(jīng)干細胞與嗅鞘細胞共移植治療創(chuàng)傷性腦損傷進行了實驗研究。本研究分為兩個部分：
　　 第一部分：嗅鞘細胞對原代培養(yǎng)神經(jīng)干細胞增殖、分化的影響。
　　 目的：觀察在體外培養(yǎng)條件下嗅鞘細胞(OECs)對神經(jīng)干細胞(NSCs)增殖、分化的影響規(guī)律，為兩者共移植于體內(nèi)促進神經(jīng)功能恢復提供可借鑒的理論依據(jù)。
　　 方法：取胎鼠腦OECs和NSCs分別進行原代培養(yǎng)，采用免疫熒光及免疫細胞化學方法鑒定相關細胞，每天在倒置

2、顯微鏡下觀察細胞生長情況。設立實驗組和對照組觀察OECs對原代培養(yǎng)NSCs增殖、分化的影響。其中實驗組：取原代OECs和NSCs濃度均為1×105個/ml各2ml分別置入培養(yǎng)板的兩個相鄰培養(yǎng)孔中并去除間隔，使OECs和NSCs共用一培養(yǎng)體系，加入維持培養(yǎng)基觀察1～7d懸浮的NSCs增殖情況并進行計數(shù)；另一培養(yǎng)板中加入分化培養(yǎng)基，分別于4d、7d用免疫細胞化學法行NF200和GFAP染色，顯微鏡下觀察NSCs分化情況。對照組：單獨培養(yǎng)NS

3、Cs，其余同實驗組。數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差顯示，分別采用SPSS13.0兩樣本t檢驗和方差分析進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為有顯著差異。
　　 結(jié)果：代培養(yǎng)的OECs和NSCs經(jīng)鑒定均符合實驗要求，OECs表達神經(jīng)生長因子受體(P75NGFR)，神經(jīng)球表達巢蛋白(Nestin)，神經(jīng)球分化的細胞表達神經(jīng)絲200(NF200)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)。在增殖實驗中，前3天兩組細胞數(shù)量無統(tǒng)計學意義，自第4天起實驗組NSCs數(shù)量較對

4、照組明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。實驗組細胞數(shù)量在第5天達到高峰，以后懸浮細胞逐漸貼壁，并開始分化，部分細胞變黑皺縮；對照組在第3天細胞數(shù)達到高峰，以后逐漸貼壁分化或皺縮。在誘導分化實驗中，實驗組4d、7d時NF200陽性細胞率較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明兩種細胞共培養(yǎng)4d、7d時，OECs提高了NSCs向NF200陽性細胞分化率；實驗組7d時GFAP陽性細胞數(shù)較對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義

5、(P＜0.05)，提示NSCs分化培養(yǎng)7d時，OECs降低了NSCs向GFAP陽性細胞分化率。
　　 結(jié)論：體外培養(yǎng)條件下OECs可促進NSCs增殖，并提高了NSCs向神經(jīng)元分化效率。
　　 第二部分：神經(jīng)干細胞與嗅鞘細胞共移植治療大鼠創(chuàng)傷性腦損傷的實驗研究。
　　 目的：觀察NSCs和OECs聯(lián)合移植對大鼠顱腦損傷的修復作用。
　　 方法：選用清潔級SD大鼠(上海斯萊科公司提供)80只，參考王占祥等介紹

6、的動物模型制作方法，直接以牙科鉆頭損傷運動區(qū)制作動物模型，剔除死亡或失敗模型后，獲得成功創(chuàng)傷性腦損傷模型大鼠64只采用隨機數(shù)字表法分成A、B、C、D4組，每組16只，分別在立體定向下行腦損傷灶邊緣注射移植。A組為對照組，單純注射生理鹽水10ul，不行細胞移植；B組為NSCs組，單獨注射NSCs懸液濃度4×104/ul，共10ul；C組為OECs組，單獨注射OECs懸液濃度4×104/ul，共10ul；D組為共移植組，注射OECs+NSC

7、s混合懸液10ul，其中含OECs數(shù)量為40×104，NSCs數(shù)量為40×104。NSCs以Brdu標記。分別于移植后3d、7d、14d隨機處死3只大鼠，采用免疫熒光染色法觀察NSCs存活、遷移及分化的情況，其余大鼠于30d時處死，采用免疫熒光染色法觀察B、D組的Brdu+/NF200+細胞數(shù)和Brdu+細胞數(shù)；采用Bederson神經(jīng)缺損體征評分法檢測各組大鼠的運動功能。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分別行兩樣本t檢驗和重復測量方差分析

8、，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：⑴80只大鼠中因麻醉過深死亡3只，因運動區(qū)定位不準確致評分過高13只被剔除，其余64只大鼠均于術后2h左右清醒，神經(jīng)功能評分均＞2分，提示模型制作成功。各組大鼠神經(jīng)功能缺失評分隨時間延長呈總體下降趨勢。其中對照組只是術后30d的評分較第3d減低(P＜0.05)，而NSCs組、OECs組及共移植組在術后14d、30d時的評分即較術后3d時明顯減低(P＜0.05)。NSCs組及OEC

9、s組僅在術后30d時的評分明顯低于對照組(P＜0.05)，而共移植組在術后14d時的評分即較對照組明顯減低(P＜0.05)，其術后30d的評分也明顯低于NSCs組和OECs組(P＜0.05)。NSCs組與OECs組各時間的評分相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。⑵HE染色光鏡下見損傷區(qū)腦組織破壞明顯，正常結(jié)構不清，周圍形成明顯的水腫帶，血管受壓變形，細胞呈不規(guī)則狀，細胞核偏移，移植的NSCs以針道為中心，分布在針道兩側(cè)，中心細胞密度

10、較高，隨著向兩邊的延伸，細胞密度逐漸降低。移植7d后，移植細胞進一步向兩側(cè)遷移，可觀察到少量壞死的細胞，損傷區(qū)組織有一定程度修復。⑶熒光顯微鏡下Brdu免疫熒光染色陽性的NSCs呈較強的綠色，細胞呈圓形，部分呈梭形，少數(shù)形態(tài)不規(guī)則，個別細胞呈碎片狀。單獨NSCs組和共移植組可見Brdu+細胞大量出現(xiàn)在損傷中心區(qū)域，沿針道分布，損傷區(qū)遠隔處較少。7d時可見Brdu+細胞明顯向周圍遷移，14d時Brdu+細胞出現(xiàn)在遠隔部位，最遠距離可達2m

11、m。對照組及OECs移植組免疫熒光染色均未發(fā)現(xiàn)Brdu+細胞。⑷對照組14d后在損傷區(qū)出現(xiàn)零星的NF200+細胞；OECs移植組在7d出現(xiàn)NF200+細胞，數(shù)量很少，14d后數(shù)量有所增加，30d時數(shù)量變化不大；單獨NSCs組和共移植組在7d時針道附近就可見大量綠色熒光Brdu+細胞，呈橢圓形，突起較少，兩組Brdu+/NF200+細胞較少，主要集中在移植區(qū)域內(nèi)。14d時兩組Brdu+細胞明顯增多，Brdu+/NF200+細胞也逐漸增多。

12、30d時NSCs組的Brdu+細胞數(shù)量變化不大，共移植組Brdu+細胞數(shù)量明顯較NSCs組多，差異有統(tǒng)計學意義(349.846±1.068vs312±2.000，p＜0.05)；Brdu+/NF200+細胞數(shù)量NSCs+OECs組也較NSCs組多，差異有統(tǒng)計學意義，(40.231±1.166vs23.231±6.572，p＜0.05)。以上結(jié)果提示在受損腦組織中，OECs有利于NSCs存活、遷移并可促進向神經(jīng)元分化。
　　 結(jié)論