轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合移植治療大鼠創(chuàng)傷性腦外傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦外傷(traumaticbraininjury，TBI)常常引起神經(jīng)細(xì)胞大量的死亡和嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺乏再生能力，因此目前認(rèn)為治療創(chuàng)傷性腦外傷的關(guān)鍵是：移植外源性細(xì)胞補(bǔ)充或替代損失的神經(jīng)細(xì)胞和施加外源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)殘存神經(jīng)細(xì)胞的存活、軸突的生長和功能性突觸的重建。因此，移植轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞治療創(chuàng)傷性腦外傷具有良好的應(yīng)用前景，一方面神經(jīng)干細(xì)胞可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)良好地整合，補(bǔ)充或替代損失的細(xì)胞，參與神經(jīng)結(jié)

2、構(gòu)的重建，另一方面其分泌的外源性細(xì)胞因子可以改善損傷局部的微環(huán)境促進(jìn)神經(jīng)再生。在本研究中，我們在探討移植神經(jīng)干細(xì)胞促進(jìn)創(chuàng)傷性腦外傷大鼠神經(jīng)功能障礙改善的機(jī)制的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討移植hBDNF轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞和hVEGFi65轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞對創(chuàng)傷性腦外傷大鼠神經(jīng)功能障礙和學(xué)習(xí)記憶功能障礙改善的影響。 一、神經(jīng)干細(xì)胞移植促進(jìn)創(chuàng)傷性腦外傷大鼠神經(jīng)功能障礙改善的實(shí)驗(yàn)研究 建立大鼠創(chuàng)傷性腦外傷模型，并分為3組，I組為對照組不移植

3、、II組移植PBS、ⅡI組移植神經(jīng)干細(xì)胞。用TUNEL法檢測外傷后24h和移植后3d、7d、2w和3w時(shí)大鼠大腦皮層、白質(zhì)和海馬中神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測在移植后3d、7d、2w時(shí)移植細(xì)胞在宿主腦內(nèi)存活、遷移和分化情況。應(yīng)用RT—PCR法檢測損傷局部中細(xì)胞因子的表達(dá)水平。應(yīng)用NSS評(píng)分評(píng)價(jià)外傷后大鼠神經(jīng)功能情況。結(jié)果：神經(jīng)干細(xì)胞移植后可以在體內(nèi)長期存活，并可以由移植點(diǎn)向損傷灶方向遷移。在移植后7d可以觀察到由移植細(xì)

4、胞分化而來的星形膠質(zhì)細(xì)胞，在移植后14d可以觀察到由移植細(xì)胞分化而來的神經(jīng)元。RT—PCR結(jié)果表明移植后7d，與I組相比，III組大鼠損傷局部NGF、BDNF、GDNF和CNTF的表達(dá)水平明顯增高(P<0．05)。TUNEL結(jié)果表明在移植后7d，ⅡI組大鼠皮層、白質(zhì)和海馬中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡數(shù)量明顯低于I組大鼠(P<0．05)。NSS評(píng)分顯示在移植后7d，IⅡ組大鼠NSS評(píng)分明顯低于I組大鼠(P<0．05)。結(jié)論：移植的神經(jīng)干細(xì)胞可以通過上

5、調(diào)損傷局部神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)水平發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。 二、hFIDNF真核細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建和穩(wěn)定表達(dá)hBNDF基因神經(jīng)干細(xì)胞克隆的建立 (一)攜帶IRES的hBDNF綠色熒光蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 采用PCR方法從正常人基因組中擴(kuò)增出hBDNF基因，用XhoI和SalI雙酶切后克隆到真核細(xì)胞表達(dá)載體plRES2～EGFP中，對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、PCR和質(zhì)粒測序鑒定后，采用陽離子脂質(zhì)體Lipo~ectamine

6、2000將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞(293一T)中，用RT-PCR、WesternBlotting、熒光顯微鏡檢測基因在239一T細(xì)胞中表達(dá)的情況。結(jié)果：雙酶切、PCR和質(zhì)粒測序結(jié)果證明hBDNF已正確地克隆到真核表達(dá)載體plRES2一EGFP中，質(zhì)粒能在293一T細(xì)胞中正常表達(dá)。結(jié)論：我們成功構(gòu)建了plRES2一hBDNF—EGFP表達(dá)載體，為利用hBDNF治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 (二)穩(wěn)定表達(dá)plRES2-h

7、BDNF—EGFP神經(jīng)干細(xì)胞克隆的建立和鑒定將10gg去內(nèi)毒素質(zhì)粒和1×106個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞在200lI低滲透壓緩沖液中混勻，分別以電壓300V一900V,脈沖時(shí)間50gs一150gs條件進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48h后用流式細(xì)胞儀分析各種條件的轉(zhuǎn)染效率。應(yīng)用含有200[tg／mLG418的培養(yǎng)液篩選轉(zhuǎn)染后的神經(jīng)干細(xì)胞14d，以獲得穩(wěn)定表達(dá)EGFP的神經(jīng)干細(xì)胞克隆。將穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆進(jìn)行單細(xì)胞克隆培養(yǎng)以純化穩(wěn)定表達(dá)EGFP的神經(jīng)干細(xì)胞。擴(kuò)增

8、穩(wěn)定表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀和RT—PCR分析轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)外源性基因的情況。結(jié)果：流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明在電壓為700V、脈沖長度為100gs時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，為12．65％。電穿孔后，細(xì)胞經(jīng)過G418篩選14d后可以獲得少量穩(wěn)定表達(dá)EGFP的神經(jīng)干細(xì)胞克隆。將表達(dá)EGFP的細(xì)胞克隆進(jìn)行單細(xì)胞克隆培養(yǎng)后可以獲得純化的細(xì)胞克隆。純化的細(xì)胞克隆擴(kuò)增后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測證明98％以上表達(dá)EGFP，RT—PCR檢測證

9、明穩(wěn)定表達(dá)EGFP的神經(jīng)干細(xì)胞同樣表達(dá)hBDNF基因。結(jié)論：電穿孔法可以有效的轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，最佳的電穿孔參數(shù)為電壓為700V，脈沖長度為100gs，經(jīng)過G418篩選后可以獲得穩(wěn)定表EGFP和hBDNF基因的神經(jīng)干細(xì)胞克隆。 三、轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合移植治療大鼠創(chuàng)傷性腦外傷的實(shí)驗(yàn)研究 將腦外傷大鼠模型分為5組，I組不移植，II組移植神經(jīng)干細(xì)胞，III組移植hVEGFl65轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞，Ⅳ移植hBDNF轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞

10、，V組移植hVEGFl65轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞和hBDNF轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞。在移植后3d、7d、2w和3w通過熒光顯微鏡觀察移植細(xì)胞在腦內(nèi)的存活、遷移和分化。應(yīng)用RT—PCR和ELISA法檢測轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞在腦內(nèi)表達(dá)外源性基因的情況。應(yīng)用TUNEL法和免疫組織化學(xué)染色法分析在外傷后大鼠內(nèi)源性新生神經(jīng)元、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、遷移至損傷灶邊緣的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量和微血管密度的變化情況。應(yīng)用NSS評(píng)分和Morris水迷宮測試評(píng)價(jià)移植細(xì)胞對大鼠神經(jīng)功能障礙

11、、學(xué)習(xí)記憶功能障礙恢復(fù)的影響。結(jié)果：hBDNF在體內(nèi)可以長期表達(dá)，而hVEGFl65在體內(nèi)的表達(dá)僅維持在4w內(nèi)。移植后3d，Ⅳ組和V組大鼠各腦區(qū)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯低于I組大鼠(P<0．01)，移植后7d，II組和IⅡ組大鼠各腦區(qū)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯低于I組大鼠(P<0．05)。移植后3w，Ⅳ組和V組大鼠的平均逃避潛伏期明顯低于I組大鼠(P<0．05)，移植后5w，IⅡ組大鼠的平均逃避潛伏期明顯低于I組大鼠(P<0．05)。移植后7

12、d，與I組大鼠相比，III組和V組大鼠的損傷局部微血管密度明顯增高(P<0．01)，遷移至損傷灶邊緣的細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0．01)。在移植后3d，Ⅳ組和V組大鼠NSS評(píng)分明顯低于I組大鼠(P<0．05)，移植后7d，II組和III組大鼠NSS評(píng)分明顯低于I組大鼠(P<0．05)。結(jié)論：移植hVEGFl65轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞和hBDNF轉(zhuǎn)基因的神經(jīng)干細(xì)胞都能夠促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能和學(xué)習(xí)記憶功能障礙的恢復(fù)，但是兩者聯(lián)合移植時(shí)產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用