體外轉(zhuǎn)染CyclinA2基因?qū)υ笫笮募〖毎鲋车挠绊?pdf

1、背景：
　　臨床上對心血管惡性事件的救治主要依賴于藥物控制和手術(shù)干預(yù)，但是從治療效果和長遠收益來看，心肌梗死的死亡率只是得到了暫時的控制，而心力衰竭的死亡風(fēng)險卻在無形加劇。以干細胞替代治療為主的實驗研究，近年來已廣泛開展，但仍受細胞來源、移植風(fēng)險等客觀因素的影響，同時又受倫理道德等因素的約束，在臨床上尚未大規(guī)模應(yīng)用。眾所周知，成熟心肌細胞增殖能力很低，一旦受到損傷，導(dǎo)致大量心肌細胞壞死，心臟功能受損甚至衰竭，若能誘導(dǎo)成熟的心肌細胞

2、進行分裂增殖，心臟再生的難題就有望得到徹底攻克。然而有關(guān)心肌細胞增殖再生方面尚有諸多問題。CyclinA2基因作為細胞周期的一個主控因子控制著細胞周期各個時相的及時轉(zhuǎn)換和循環(huán)往復(fù)，對細胞周期正確發(fā)揮其調(diào)控作用至關(guān)重要，對于解決心肌再生問題具有很高的研究價值。
　　目的：
　　探討體外轉(zhuǎn)染細胞周期素A2(Cyclin A2)基因?qū)υ笫笮募〖毎鲋车挠绊?，為心臟再生提供細胞學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.心肌細胞原

3、代培養(yǎng)采用酶聯(lián)合消化法結(jié)合差速貼壁法，分離、培養(yǎng)、純化大鼠乳鼠原代心肌細胞，在活細胞工作站下實時動態(tài)監(jiān)測細胞的生長狀態(tài)，攝片記錄原代培養(yǎng)過程中心肌細胞的形態(tài)變化。
　　2.基因轉(zhuǎn)染心肌細胞原代培養(yǎng)第3天，分別轉(zhuǎn)染帶有預(yù)先包裝好的攜帶目的基因Cyclin A2的重組腺病毒和僅含有綠色熒光蛋白的空病毒。
　　3.實驗分組(1)重組腺病毒Cyclin A2基因轉(zhuǎn)染組:轉(zhuǎn)染帶有強化綠色熒光蛋白(Green Fluorescent P

4、rotein，GFP)和Cyclin A2基因的重組腺病毒(Ad-Cyclin A2-GFP);(2)空病毒轉(zhuǎn)染組:轉(zhuǎn)染不含目的基因僅有GFP的重組腺病毒(Ad-Null-GFP);(3)陰性對照組:未做轉(zhuǎn)染處理，僅加入等量的培養(yǎng)基。
　　4.GFP示蹤技術(shù)和統(tǒng)計學(xué)分析評估原代大鼠心肌細胞的基因轉(zhuǎn)染效率;對比實驗組（重組腺病毒Cyclin A2基因轉(zhuǎn)染組）和空病毒載體轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率有無差異。
　　5.間接法免疫熒光雙重標(biāo)記

5、轉(zhuǎn)染后的細胞繼續(xù)體外培養(yǎng)3-5 d，利用免疫熒光技術(shù)分別檢測Cyclin A2、磷酸化組蛋白H3(Phosphorylates Histone H3，H3P)、心肌肌鈣蛋白-T(Cardiac Troponin T，cTnT)的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.原代培養(yǎng)的心肌細胞8-12h后多貼壁生長，并可見單個搏動的心肌細胞，頻率約13-44次/分。3-5 d后細胞匯集成片狀，形成細胞簇或單層細胞，搏動趨近同步性，收縮明顯有

6、力，頻率約46-182次/分。
　　2.熒光GFP示蹤表明:重組腺病毒Cyclin A2轉(zhuǎn)染組對心肌細胞的轉(zhuǎn)染效率略低于空病毒轉(zhuǎn)染組，空病毒載體侵染原代大鼠心肌細胞的效率幾乎達到100％，重組腺病毒Cyclin A2侵染心肌細胞效率約為(97±0.74)％，活細胞工作站下可見轉(zhuǎn)染成功的心肌細胞顯示綠色熒光，并呈現(xiàn)簇狀搏動。
　　3.免疫熒光標(biāo)記結(jié)果顯示心肌細胞特異性標(biāo)記蛋白cTnT分布于細胞質(zhì)，細胞核中不存在表達;大鼠原代心

7、肌細胞純度高達(95±0.62)％;心肌細胞CyclinA2主要在胞核內(nèi)聚集，少數(shù)分布于細胞質(zhì);H3P是一種有絲分裂期的特殊標(biāo)記蛋白，以細胞核內(nèi)分布為主。
　　4.轉(zhuǎn)染Cyclin A2基因后，心肌細胞有絲分裂指數(shù)明顯增高，約為空病毒轉(zhuǎn)染組和陰性對照組的3倍，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05); Cyclin A2基因轉(zhuǎn)染組可見大量多核細胞，以雙核為主，伴少量三核心肌細胞。
　　結(jié)論：
　　1.本研究所采用的酶聯(lián)合消