用大鼠原代心肌細(xì)胞在體外構(gòu)建工程化心肌組織的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：終末期缺血性心臟疾病的治療是目前臨床上尚未克服的難題之一。在我國(guó)，隨著人們生活水平的提高，冠心病等的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，尋找到一個(gè)能夠有效地糾正因?yàn)樾募」Ｋ涝斐傻男牧λソ摺⑩赖葒?yán)重后果的治療方法，業(yè)已成為近年來(lái)臨床科研工作的重點(diǎn)。而由心肌梗死等原因造成的終末期缺血性心臟疾病的根本原因是有功能的心肌細(xì)胞數(shù)量的減少，因此如何恢復(fù)或增加有功能心肌細(xì)胞的數(shù)量就成為科研的出發(fā)點(diǎn)。為此，人們首先想到了使用細(xì)胞移植的方法，通過(guò)局部種

2、植或血管灌注等途徑將體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞移植到心梗區(qū)域，恢復(fù)功能心肌細(xì)胞的數(shù)量，現(xiàn)己進(jìn)入Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)階段。但到目前為止細(xì)胞移植還面臨著很多的問(wèn)題，首先是種植的細(xì)胞存活率較低，與宿主組織的融合性較差，存活下來(lái)細(xì)胞的實(shí)際功能還值得懷疑，因此它的臨床實(shí)用價(jià)值尚有待觀察。為了克服這些缺點(diǎn)，近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的利用組織工程學(xué)的方法構(gòu)建工程化的心肌組織(engineering heart tissue，EHT)替代壞死的心肌組織，恢復(fù)心臟的功能被認(rèn)為是給

3、終末期缺血性心臟疾病的治療帶來(lái)了希望。組織工程學(xué)(tissueengineering，TE)是繼遺傳工程學(xué)之后新近發(fā)展起來(lái)的一門新興的應(yīng)用科學(xué)，是研究開發(fā)用于修復(fù)和改善損傷組織結(jié)構(gòu)和功能的生物替代物的一門科學(xué)。其核心是模擬體內(nèi)組織發(fā)生的環(huán)境，建立由細(xì)胞和生物材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體，其發(fā)展將會(huì)對(duì)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的基本原則帶來(lái)深遠(yuǎn)而有意義的影響。它通過(guò)應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)和材料工程學(xué)方法在體內(nèi)和體外進(jìn)行組織和器官的構(gòu)建，即將獲得的少量自體細(xì)胞在體外

4、進(jìn)行擴(kuò)增后，再將這些細(xì)胞與具有較強(qiáng)生物可容性和生物可降解性的人工合成共聚物混合，從而形成細(xì)胞—支架復(fù)合物。而這些共聚物可使細(xì)胞在特定的位置種植、固定并生長(zhǎng)，為組織的形成提供模板。同時(shí)，這種細(xì)胞—支架復(fù)合物無(wú)免疫原性，且擁有和自體組織類似的結(jié)構(gòu)和功能，因此被認(rèn)為具有廣泛的應(yīng)用前景。目前實(shí)驗(yàn)已經(jīng)對(duì)不同組織，包括骨、軟骨、肌腱、皮膚，血管和角膜等進(jìn)行了成功的構(gòu)建，并已經(jīng)被臨床用于修復(fù)多種組織缺損，取得了令人滿意的效果。組織工程學(xué)在心臟外科亦有

5、著廣泛的應(yīng)用前景，包括構(gòu)建工程化心肌組織、工程化心臟瓣膜、工程化血管等均成為研究的目標(biāo)，其中對(duì)工程化心臟瓣膜的研究已取得積極的進(jìn)展，但在工程化心肌組織構(gòu)建方面的研究才剛剛起步，還面臨著一系列的問(wèn)題。首先是種子細(xì)胞的選擇，如何獲取純度較高的心肌細(xì)胞，還需從各種種子細(xì)胞中進(jìn)行篩選；其次是支架材料的選擇，目前應(yīng)用的材料在生物力學(xué)特性上還不能滿足臨床使用的要求，還無(wú)法承受左心室巨大壓力的沖擊，因此還有待進(jìn)一步的研究和改進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)將就EHT的體外

6、構(gòu)建進(jìn)行初步的探討。目的探討用大鼠原代心肌細(xì)胞和生物可降解材料聚乙醇酸/聚乳酸共聚物(polyglycolic acid and polylactic acid，PLGA)在體外構(gòu)建工程化心肌組織的可行性。 方法：用0.125％胰蛋白酶和0.01％的EDTA從新生大鼠心臟組織中消化分離出心肌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)；用多聚L-賴氨酸(PLL)對(duì)支架材料PLGA進(jìn)行修飾，將具有活力的心肌細(xì)胞種植于PLGA上并使其固定、生長(zhǎng)，構(gòu)建工程化心肌

7、組織片。應(yīng)用免疫組織化學(xué)和RT-PCR的方法進(jìn)行心肌細(xì)胞鑒定和檢測(cè)，并應(yīng)用掃描電子顯微鏡對(duì)細(xì)胞-支架復(fù)合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)掃描，以及HE染色的方法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及其與材料的融合情況。 結(jié)果：分離后的原代心肌細(xì)胞在DMEM營(yíng)養(yǎng)液中貼壁生長(zhǎng)良好，細(xì)胞存活率在93％以上，并且具有自發(fā)搏動(dòng)的能力，以5—14d左右時(shí)間內(nèi)活力最強(qiáng)；利用細(xì)胞差時(shí)貼壁的原理并在培養(yǎng)液中加用5-Brdu后，心肌細(xì)胞純度可達(dá)95％以上，并保持有一定的增殖能力。細(xì)胞免疫組織化

8、學(xué)鑒定α-肌動(dòng)蛋白(α-Actin)和結(jié)蛋白(Desmin)均呈陽(yáng)性表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)到心肌細(xì)胞特異性基因GATA-4和Nkx2.5的表達(dá)。在多聚L-賴氨酸的修飾作用下，原代心肌細(xì)胞能夠在支架材料PLGA上種植、固定并生長(zhǎng)。HE染色及電鏡掃描觀察均見(jiàn)心肌細(xì)胞沿支架材料纖維附著生長(zhǎng)，分布均勻，相互融合。 結(jié)論：原代心肌細(xì)胞可以作為組織工程學(xué)研究的種子細(xì)胞，它能夠在聚酯類支架材料上種植、固定并生長(zhǎng)，在體外成功構(gòu)建工程化的心肌組織