構(gòu)建組織工程化心肌組織的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:心臟疾患目前已成為工業(yè)化社會(huì)引起死亡的頭號(hào)殺手，心肌梗死和心力衰竭致使患者的心臟組織發(fā)生大面積病理性改變。成年心肌細(xì)胞為高度分化的終末細(xì)胞，不能再生。對(duì)于心力衰竭末期的病人，進(jìn)行心臟移植是最有效的方法，但是心臟移植存在合適供體來(lái)源的限制，故廣泛推廣該技術(shù)困難重重。隨著心力衰竭病人數(shù)量的增加，尋找新的治療策略勢(shì)在必行。 目的:本研究應(yīng)用在體外培養(yǎng)中性能比較穩(wěn)定的大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞，探索構(gòu)建工程化心肌組織(EHT)的方法，在

2、建立成熟可行的方法后，選擇具有再生能力的胚胎干細(xì)胞(ES)做為種子細(xì)胞構(gòu)建EHT，以期構(gòu)建出再生組織，替換和修補(bǔ)有病變的心肌組織。 方法: (1)應(yīng)用大鼠乳鼠心肌細(xì)胞構(gòu)建心肌組織。比較了0.04％EDTA+0.25％胰酶和0.1％胰酶消化法，對(duì)心肌細(xì)胞收獲量和活力水平的影響。將收獲的心肌細(xì)胞與液態(tài)膠原、Matrigel、2×DMEM混合，注入環(huán)形槽內(nèi)形成心肌條帶，培養(yǎng)一周后行力學(xué)拉伸，繼續(xù)培養(yǎng)一周。常規(guī)H.E.染色等對(duì)E

3、HT進(jìn)行評(píng)價(jià)。考慮到環(huán)形條帶限制了體內(nèi)移植及臨床的應(yīng)用，本研究又嘗試了構(gòu)建心肌片層的方法。用膠原、Matrigel、2倍DMEM分別與制備的乳鼠原代心肌細(xì)胞混合，注入方形槽內(nèi)形成心肌片層，5d后行動(dòng)態(tài)力學(xué)拉伸繼續(xù)培養(yǎng)一周。 (2)應(yīng)用胚胎干細(xì)胞來(lái)源的心肌細(xì)胞構(gòu)建心肌組織。本研究以小鼠胚胎干細(xì)胞(mES細(xì)胞)作為種子細(xì)胞，首先應(yīng)用新型細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)-STLV型旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器(RCCS)，建立一種批量制備擬胚體(EB)的新方法。未分

4、化ES細(xì)胞在飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)復(fù)制，至匯合為集落，用胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，再經(jīng)旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器制備EB，EB貼壁后用維生素C誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞。通過(guò)光鏡觀察跳動(dòng)的心肌細(xì)胞，免疫組織化學(xué)、激光共聚焦、RT-PCR和電鏡等方法對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定。之后用Dispase酶消化貼壁生長(zhǎng)的ES源心肌細(xì)胞，獲得單細(xì)胞懸液后行Percoll分離，光鏡和免疫組織化學(xué)方法對(duì)獲得的每層細(xì)胞進(jìn)行分析，采用免疫組織化學(xué)和激光共聚焦方法鑒定細(xì)胞。經(jīng)純化的ES源心肌細(xì)胞與添

5、加了基質(zhì)蛋白和2倍DMEM的液態(tài)Ⅰ型膠原混合，在環(huán)形槽中鑄成心肌條帶，培養(yǎng)7d后取出，對(duì)其施加10％的動(dòng)態(tài)拉伸，再培養(yǎng)7d。通過(guò)光學(xué)顯微鏡、常規(guī)H.E.染色、激光共聚焦、透射電鏡觀察等對(duì)構(gòu)建的EHT進(jìn)行評(píng)價(jià)。在裸鼠皮下移植EHT4周后，行移植物的肌鈣蛋白T(cTnT)免疫組化染色。 結(jié)論:本研究對(duì)心肌細(xì)胞分離方法、膠原濃度定量方法進(jìn)行改進(jìn)，這些改進(jìn)可顯著提高構(gòu)建心肌條帶的成功率及條帶的生理功能，使其更接近正常心肌組織，并提高了實(shí)

6、驗(yàn)的可重復(fù)性。本研究表明，ES細(xì)胞可以作為組織工程的種子細(xì)胞，尤其是對(duì)于那些很難獲得目的細(xì)胞的組織構(gòu)建，選擇ES細(xì)胞具有明顯的優(yōu)勢(shì)。本研究應(yīng)用ES源細(xì)胞作為構(gòu)建EHT的細(xì)胞來(lái)源，成功地建立了一種構(gòu)建心肌組織的平臺(tái)。其成功基于以下重要環(huán)節(jié)的突破： (1)通過(guò)大鼠乳鼠心肌細(xì)胞，摸索了構(gòu)建心肌組織的技術(shù)體系； (2)生物反應(yīng)器的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了擬胚體的規(guī)?；瘮U(kuò)增； (3)用維生素C實(shí)現(xiàn)了ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞的高效分化；