FGF6基因高表達(dá)對(duì)鼠心肌細(xì)胞凋亡和增殖的影響.pdf

1、目的：克隆小鼠成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子6(FGF6)基因cDNA的讀碼框(CDS)，構(gòu)建攜帶FGF6基因的重組真核表達(dá)載體，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞系H9C2細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，測(cè)定其轉(zhuǎn)染效率后探討FGF6基因?qū)π募〖?xì)胞增殖及凋亡的影響。
　　 方法：從小鼠心臟組織中提取總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)得到總cDNA，PCR法擴(kuò)增，產(chǎn)物連接pGEM-T Easy載體測(cè)序分析正確后，再以PCR方法擴(kuò)增，將其連接入真核表達(dá)質(zhì)粒PIRES2-

2、DsRed2。以PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定正確后，將重組載體PIRES2-DsRed2-FGF6用脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)，分組:空白對(duì)照(BC)組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒(NC)組、轉(zhuǎn)染重組FGF6-PIRES2-DsRed2質(zhì)粒(P-FGF6)組，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后FGF6 mRNA表達(dá)水平，westernblot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。Cell Counting Kit-8（CCK-8）法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的

3、增殖能力;以血清饑餓法誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)進(jìn)行FGF6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)，Western blot方法檢測(cè)活化半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）表達(dá)。
　　 結(jié)果：FGF6 PCR產(chǎn)物片段與pGEM-T Easy載體連接成為重組克隆載體，測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的FGF6序列完全一致，成功克隆了小鼠FGF6基因CDS讀碼框序列;以T-FGF6為模板重新獲得含酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物片段與PIRES2-Ds

4、Red2真核表達(dá)載體雙酶切經(jīng)T4連接酶連接獲得重組真核表達(dá)載體PIRES2-DsRed2-FGF6，菌液PCR、雙酶切鑒定、測(cè)序鑒定等均證實(shí)重組真核表達(dá)載體構(gòu)建成功;且證實(shí)重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞后，48h后熒光顯微鏡下可見(jiàn)約75％H9C2細(xì)胞表達(dá)紅色熒光，檢測(cè)H9C2細(xì)胞的FGF6 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于BC組（P＜0.01）及NC組（P＜0.01），轉(zhuǎn)染FGF6基因能提高心肌細(xì)胞的增殖能力（P＜0.05），F(xiàn)GF6基