低頻脈沖磁場對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞及Cx43的影響與機制的研究.pdf

1、實驗背景和目的
　　隨著科技的飛速發(fā)展,電磁輻射的應(yīng)用越來越廣泛,各種通訊、網(wǎng)絡(luò)、醫(yī)療設(shè)備與人的關(guān)系愈加密切,磁場的作用逐漸受到人們的重視,研究顯示電磁輻射對人體產(chǎn)生損傷作用,相反也有研究顯示電磁輻射可以作為一種安全有效的物理治療手段,這些不同的結(jié)果,取決于電磁輻射的強度、頻率、時間等。據(jù)報導(dǎo),缺血性心臟病近幾年來的發(fā)病率死亡率呈逐年上升的趨勢,已成為威脅人類健康和生命的頭號殺手[1]。缺血性心臟病的發(fā)生發(fā)展與心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的

2、功能受損密切相關(guān)。因而促進(jìn)內(nèi)皮的再生是治療缺血性心臟病的主要手段。微血管內(nèi)皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞在功能上有相似之處,它參與血管的再生,對改善治療心血管疾病起到重要的作用。而細(xì)胞縫隙連接蛋白43(connexin43,Cx43)與微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長、凋亡、遷移、炎癥反應(yīng)等關(guān)系密切,甚至被認(rèn)為是心血管疾病發(fā)生的標(biāo)志性蛋白之一[2]。因此我們可以尋找一種安全有效的電磁輻射條件,在這種條件下能夠促進(jìn)微血管內(nèi)皮的再生,使新的血管生成,進(jìn)而來治療缺血性

3、心臟病。本課題擬以大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象,旨在研究低頻脈沖磁場對體外培養(yǎng)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞和Cx43蛋白表達(dá)的影響。進(jìn)一步探討低頻脈沖磁場對心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用機制,從而為臨床選擇合適的磁場治療條件治療缺血性心臟病提供理論依據(jù)和參考。
　　實驗方法:
　　1.SD成年大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng),采用胰酶、膠原酶消化培養(yǎng),差速貼壁法純化細(xì)胞,鏡下觀察并對細(xì)胞表達(dá)特異蛋白VIII因子和vWF進(jìn)行檢測,吞噬實

4、驗對細(xì)胞進(jìn)行鑒定,并用流式細(xì)胞儀檢測CMECs純度。
　　2.對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行低頻脈沖磁場照射,將細(xì)胞分為對照組與照射組,輻照時間:4h/d,連續(xù)照射7d,頻率:15Hz,場強分別為:0.8mT、1.4mT、1.8mT。用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況;流式技術(shù)檢測不同磁場強度下心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖周期變化情況;用劃痕實驗和Transwell小室法檢測不同磁場強度下心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力。
　　3.用

5、實時定量PCR方法檢測不同磁場強度下心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中Cx43mRNA含量變化。采用蛋白免疫印跡方法檢測不同磁場強度下心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中縫隙連接蛋白Cx43蛋白含量變化,采用蛋白免疫印跡方法檢測不同磁場強度下心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞MAPK通路中ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白的含量變化。實驗結(jié)果:
　　1.成功培養(yǎng)并純化原代心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞。分離純化后鏡下觀察細(xì)胞呈現(xiàn)鋪路石樣特性。CMECs中特異蛋白VIII因子和vW

6、F檢測呈陽性,吞噬Dil-Ac-LDL的CMECs成紅色顯影,流式細(xì)胞術(shù)檢測CMECs純度為97.27±0.83％。
　　2.1.4mT、1.8mT低頻電磁脈沖磁場可提高細(xì)胞的增殖水平,促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入到G2期、S期,促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲能力,與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),1.8mT可以促進(jìn)細(xì)胞分泌NO,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),1.4mT對細(xì)胞分泌NO的影響與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。0.8mT低

7、頻電磁脈沖磁場處理后細(xì)胞增殖情況、增殖周期、遷移和侵襲能力的改變及NO的分泌與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。
　　3.1.4mT、1.8mT低頻電磁脈沖磁場提高Cx43蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,提高ERK、p-ERK蛋白的水平,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),JNK、p-JNK蛋白的水平,與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。0.8mT低頻電磁脈沖磁場處理后細(xì)胞Cx43蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,ERK、p-

8、ERK、JNK、p-JNK蛋白的水平與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.低頻脈沖磁場可以提高心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力,促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入到G2期、S期,使細(xì)胞DNA合成增多;促進(jìn)細(xì)胞的遷移能力、侵襲能力;刺激細(xì)胞分泌NO。
　　2.低頻脈沖磁場可以提高Cx43的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平,增加MAPK通路ERK、p-ERK蛋白的表達(dá),推測低頻脈沖磁場可能是通過調(diào)節(jié)Cx43的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生物能