FGL2基因沉默對(duì)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：
　　 特異性沉默心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞FGL2基因的表達(dá)后，觀察細(xì)胞形態(tài)功能以及增殖、凋亡能力的變化；探討FGL2沉默在心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡方面的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 (1)分離培養(yǎng)并鑒定MMVEC：取健康級(jí)新生雄性Wistar大鼠6～8 d8只，體重8～10 g，用組織貼塊法培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞，至原代內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)成單層融合后，進(jìn)行傳代。取第三代MMECs，免疫熒光檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞重要標(biāo)志物FVⅢ及

2、CD31相關(guān)抗原。
　　 (2)從GeneBank中查找人纖維介素fg12(NM_006682)的堿基序列，按RNA干擾序列設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)4組針對(duì)FGL2基因cds區(qū)的靶序列，同時(shí)按公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)合成無(wú)意義序列作陰性對(duì)照(PSCNC)。每組序列均按發(fā)卡結(jié)構(gòu)模式設(shè)計(jì)合成，在其兩端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)粘端，合成雙鏈DNA(引物)，與經(jīng)AgeI/EcoRI酶切的pGCSIL-GFP載體連接，產(chǎn)生pGCSIL-FGL2慢病毒載體，經(jīng)電泳篩選陽(yáng)性克

3、隆，進(jìn)行基因測(cè)序鑒定。再將慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝生產(chǎn)慢病毒，以系列稀釋法測(cè)定病毒滴度，Westernblot篩選出有效干擾靶點(diǎn)。DNA片段均由上海吉?jiǎng)P基因公司合成。
　　 (3)實(shí)驗(yàn)分組：取培養(yǎng)的第三代MMVECs，共分三組：實(shí)驗(yàn)A組：?jiǎn)渭僊MVECs(空白對(duì)照組)；實(shí)驗(yàn)B組；空載質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染MMVECs組；實(shí)驗(yàn)C組：FGL2RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染MMVECs組。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染4天后，熒光實(shí)時(shí)定量PCR(quantitativ

4、e real-time RT-PCR，qRT-PCR)檢測(cè)各組Bax、Bc1-2、Cox-2的mRNA表達(dá)。Westernblot檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染后MMVECs中FGL2蛋白的表達(dá)情況。病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖能力用MTT法檢測(cè)。細(xì)胞的凋亡能力通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)原代心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)成功，細(xì)胞呈典型的鋪路石樣結(jié)構(gòu)，純度約95％左右。
　　 (2)免疫熒光法檢測(cè)，顯示90％以上的細(xì)胞CD3

5、1、FVⅢ陽(yáng)性，CD31主要分布在細(xì)胞膜，呈紅色熒光，F(xiàn)VⅢ主要分布在細(xì)胞胞漿，呈綠色熒光。
　　 (3)通過(guò)基因測(cè)序，表明FGL2RNAi慢病毒載體構(gòu)建成功。系列稀釋法測(cè)試包裝濃縮的慢病毒滴度為1×109TU/ml。轉(zhuǎn)染FGL2RNAi慢病毒96 h后，70-80％的MMVECs表達(dá)綠色熒光；MTT、流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)C組與其它兩組細(xì)胞相比：細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)，凋亡明顯減少；qRT-PCR結(jié)果顯示，與實(shí)驗(yàn)A組與B組比

6、較，實(shí)驗(yàn)C組的FGL2、Bax、Cox-2表達(dá)明顯下調(diào)，Bc1-2的表達(dá)明顯上調(diào)，Westernblot檢測(cè)示：實(shí)驗(yàn)C組FGL2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)A組與B組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 原代大鼠的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)成功，轉(zhuǎn)染FGL2RNAi慢病毒后的MMVECs中FGL2在RNA及蛋白水平表達(dá)明顯下調(diào)，在RNA水平Bc1-2表達(dá)明顯上調(diào)，Cox-2、Bax表達(dá)水平明