紅車軸草總黃酮對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、缺血性心臟?。ㄓ址Q冠心病，Coronary Artery Disease）的發(fā)病率和致死率逐年增高，已成為威脅人類健康的重大疾病之一。近年來(lái)其發(fā)病年齡逐漸有年輕化的趨勢(shì)，因而引起了廣泛的關(guān)注。
　　 動(dòng)脈粥樣硬化是誘發(fā)冠心病的始動(dòng)因素，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵因素。心肌細(xì)胞壞死是冠心病的晚期病理特征，心肌細(xì)胞損傷是導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死的重要因素。因而，內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞損傷是導(dǎo)致冠心病發(fā)生發(fā)展的重要病理因素。大量研究

2、表明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞損傷的主要原因。氧化應(yīng)激是指部分還原形態(tài)的氧離子即活性氧自由基(Reactive Oxygen Species，ROS)的生成超過(guò)了細(xì)胞內(nèi)源性解毒和/或使用能力的非穩(wěn)定狀態(tài)，體內(nèi)過(guò)多的氧自由基將作用于蛋白質(zhì)、核酸、脂類等生物大分子，并直接或間接地激活細(xì)胞內(nèi)的多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因而尋找具有抗氧化應(yīng)激作用的化合物對(duì)于冠心病的預(yù)防和治療都具有重要的

3、臨床意義。
　　 具有抗氧化作用的黃酮類化合物是治療和預(yù)防心血管疾病中草藥的主要有效成分，研究發(fā)現(xiàn)紅車軸草富含黃酮類成分，且紅車軸草總黃酮(Red Clover Flavonoids,RCF)具有抗氧化作用，大量研究表明其在預(yù)防和治療心血管疾病中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。而且，紅車軸草來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉，具有明顯的新藥研發(fā)優(yōu)勢(shì)。但目前關(guān)于紅車軸草總黃酮對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制均鮮有報(bào)道。因而本實(shí)驗(yàn)一

4、方面采用體外細(xì)胞培養(yǎng)，建立以H2O2為刺激因素的氧化應(yīng)激損傷模型，探究紅車軸草總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并探討其初步作用機(jī)制;另一方面采用異丙腎上腺素(Isoprotenenol，ISO)誘導(dǎo)大鼠急性心肌缺血模型，探討紅車軸草總黃酮對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠急性心肌缺血的保護(hù)作用及作用機(jī)制，以期為開發(fā)紅車軸草總黃酮治療缺血性心臟病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 本課題分為三個(gè)部分:
　　 第一部分紅車軸

5、草總黃酮對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?研究紅車軸草總黃酮對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并進(jìn)一步探究其作用機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:利用體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304，采用H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模型，觀察紅車軸草總黃酮對(duì)H2O2所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率、試劑盒測(cè)定細(xì)胞中超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GS

6、H-Px)活性及細(xì)胞中丙二醛(MDA)的含量、乳酸脫氫酶(LDH)的漏出量;分光光度計(jì)法檢測(cè)Caspase-3的活性;Hoechst33342及PI熒光染色法觀察紅車軸草總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響;JC-1染色法檢測(cè)紅車軸草總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位的影響，檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)水平。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:與空白對(duì)照組相比，模型組血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率降低、細(xì)胞內(nèi)LDH漏出量顯著增加(P＜0.001

7、);抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性顯著降低、MDA含量顯著升高(P＜0.01)、Caspase-3活性升高（P＜0.001）、ROS含量升高、線粒體膜電位降低;與模型組相比，紅車軸草總黃酮各劑量組(12.5、25、50μg/mL)及槲皮素組(30μg/mL)細(xì)胞存活率明顯增加（P＜0.01，P＜0.05），紅車軸草總黃酮各劑量組(12.5、25、50μg/mL)及槲皮素組（30μg/mL）均能顯著降低LDH漏出量(P＜0.01

8、，P＜0.05)、明顯增強(qiáng)SOD、CAT及GSH-Px活力（P＜0.01，P＜0.05）、降低MDA、ROS含量及Caspase-3活性(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)、升高線粒體膜電位(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:紅車軸草總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用，其初步作用機(jī)制可能與抗自由基、減輕脂質(zhì)過(guò)氧化、降低Caspase-3活性及穩(wěn)定線粒體膜電位有關(guān)。
　　 第二部分紅車軸草總黃酮對(duì)

9、過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2損傷的保護(hù)作用
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?研究紅車軸草總黃酮對(duì)過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并進(jìn)一步探究其作用機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:采用H9c2心肌細(xì)胞細(xì)胞系，建立H2O2損傷模型，培養(yǎng)24 h后隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、紅車軸草總黃酮組(25、50、100μg/mL)及槲皮素組(20μg/mL)，各給藥組預(yù)孵育6h后進(jìn)行H2O2損傷造模。觀察紅車軸草總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌

10、細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的量效、時(shí)效關(guān)系，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，試劑盒檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)的漏出量、丙二醛(MDA)的含量、過(guò)氧化氫酶(CAT)及超氧化物歧化酶(SOD)活力。H33342及PI熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。檢測(cè)各組細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2、MAPK家族（JNK、ERK、P38）及其磷酸化形式(p-JNK、p-ERK、p-P38)等蛋白的蛋白表達(dá)水平。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:與空白對(duì)照組相比，模型組心肌

11、細(xì)胞存活率降低、細(xì)胞內(nèi)LDH漏出量增加、SOD活性降低、MDA含量升高、CAT活性降低(P＜0.001)、細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平升高、MAPK家族的磷酸化形式(p-JNK、p-ERK、p-P38)表達(dá)水平升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平下降;與模型組相比，預(yù)孵育6h后，紅車軸草總黃酮各處理組（50、100.μg/mL）細(xì)胞存活率明顯增加(P＜0.001)，紅車軸草總黃酮各處理組及槲皮素組均能非常明顯降低LDH漏出量(P＜0.0

12、01)、明顯增強(qiáng)SOD和CAT活力、降低MDA含量(P＜0.01)，細(xì)胞內(nèi)Bax表達(dá)水平下降，MAPK家族的磷酸化形式(p-JNK、p-ERK、p-P38)表達(dá)水平下降，Bcl-2表達(dá)水平升高。
　　 結(jié)論:紅車軸草總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用，其初步作用機(jī)制可能與抗自由基、減輕脂質(zhì)過(guò)氧化作用、下調(diào)Bax表達(dá)、上調(diào)Bcl-2表達(dá)及調(diào)節(jié)MAPK家族相關(guān)蛋白的磷酸化等有關(guān)。
　　 第三部分紅車軸草總黃酮

13、對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠急性心肌缺血的保護(hù)作用
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?探討紅車軸草總黃酮對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠急性心肌缺血的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:探討紅車軸草總黃酮對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠急性心肌缺血的保護(hù)作用。將紅車軸草總黃酮按高、中、低(200、100、50 mg/kg)三個(gè)劑量對(duì)SD大鼠進(jìn)行灌胃給藥15天，于給藥第14、15天大鼠皮下注射異丙腎上腺素(4 mg/kg，s.c.)，給藥結(jié)束后腹主動(dòng)脈取血

14、，檢測(cè)血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的水平;4％多聚甲醛灌注后對(duì)心臟行HE染色;檢測(cè)心臟組織中丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽還原酶(GR)的活力及過(guò)氧化物酶(POD)、活性氧自由基(ROS)的水平。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:與空白對(duì)照組相比;異丙腎上腺素模型組血清中;AST、CK、LDH水平顯著升高(P＜0.01

15、)，心臟組織中SOD、T-AOC、GR、GSH-Px、POD活力顯著降低(P＜0.01)，MDA和ROS含量顯著升高(P＜0.01);而給予紅車軸草總黃酮后，可顯著抑制血清中AST、CK、LDH水平的升高，顯著抑制心臟組織中SOD、T-AOC、GR、GSH-Px、POD活力的降低(P＜0.01)，對(duì)心肌細(xì)胞有良好的保護(hù)作用。
　　 結(jié)論:紅車軸草總黃酮對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠急性心肌缺血有明顯的保護(hù)作用，其初步作用機(jī)制可能與抗自