抗氧化基因在大豆異黃酮抑制內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是全球頭號(hào)致死病因，且其流行趨勢(shì)不斷加劇，我國(guó)AS的發(fā)病率也呈逐年升高的態(tài)勢(shì)。流行病學(xué)證據(jù)顯示，心血管疾病(Cardiovasculardiseases，CVD)的患病率通常為男性高于同齡的絕經(jīng)前女性，但女性絕經(jīng)后由于體內(nèi)雌激素水平急劇下降，其CVD患病率卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于男性。大量研究表明，雌激素替代療法(Hormone replacement therapy，HRT)能夠降在一定程度上降低

2、絕經(jīng)后女性心血管疾病的發(fā)病率，卻會(huì)顯著增加此類人群中風(fēng)和惡性腫瘤的罹患風(fēng)險(xiǎn)。在尋找HRT的替代療法時(shí)，許多研究都圍繞選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(Selected estrogen receptormodulators，SERMs)而開(kāi)展，如化學(xué)合成藥物雷洛昔芬(Raloxifene)和抗雌激素他莫昔芬(Tamoxifen)。一項(xiàng)名為RUTH(Raloxifene Use for the Heart)的大規(guī)模臨床實(shí)驗(yàn)對(duì)SERMs用于預(yù)防冠心病

3、的長(zhǎng)效性和安全性以及對(duì)罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評(píng)估。這項(xiàng)為期5.6年的跟蹤干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雷洛昔芬對(duì)絕經(jīng)后婦女的心血管系統(tǒng)并無(wú)保護(hù)作用，反而進(jìn)一步警告其可能帶來(lái)的血栓形成和中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，尋找天然無(wú)毒副作用的SERMs成為研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，膳食中富含大豆或大豆制品的亞洲人中，其CVD的發(fā)病率顯著低于沒(méi)有大豆或大豆制品飲食習(xí)慣的歐美人。大豆異黃酮(Soy isoflavone，SI)是主要存在于豆科植物中的一類植物雌

4、激素，SI具有類雌激素活性，能雙向調(diào)節(jié)雌激素受體(Estrogen receptor，ER)活性，是一類天然的SERMs。近年來(lái)，大量的研究表明，SI的抗氧化效應(yīng)介導(dǎo)了其廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，包括防治CVD、更年期綜合癥、骨質(zhì)疏松、乳腺癌和前列腺癌等疾病，是一類優(yōu)良的天然抗氧化劑。因此，研究和開(kāi)發(fā)安全有效的天然SERMs或抗氧化劑成為AS早期防治的有效途徑。而且作為天然存在的營(yíng)養(yǎng)素成分，植物雌激素較藥物而言具有更高的安全性，患者更易接納，因

5、此，對(duì)SI抗氧化劑機(jī)制的研究對(duì)開(kāi)發(fā)防治AS的天然抗氧化藥物具有重要意義。
　　 第一部分染料木素對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　 染料木素(Genistein)，又稱染料木黃酮、金雀異黃酮，或5，7，4’-三羥異黃酮，屬于異黃酮類，是主要存在于豆科植物中的一類重要的植物雌激素。染料木素分子結(jié)構(gòu)與雌二醇相似，能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合雌激素受體，具有弱雌激素活性。由于其分子結(jié)構(gòu)含有三個(gè)酚羥基，故染料木素又具有一定的抗

6、氧化效應(yīng)。染料木素和大豆苷元(Daidzein)是近十年來(lái)被研究得最多的異黃酮類化合物。大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，SI的抗氧化活性和雌激素受體結(jié)合活性介導(dǎo)了其廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，包括防治AS、婦女更年期癥狀、骨質(zhì)疏松、前列腺癌和乳腺癌等。因此，特別是在營(yíng)養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域，人們對(duì)SI的研究興趣方興未艾。
　　 Nrf2(NF-E2-related factor2)是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)對(duì)氧化應(yīng)激應(yīng)答和外源物質(zhì)代謝的一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它通過(guò)與抗氧化元件(A

7、ntioxiant response element，ARE)結(jié)合，上調(diào)ARE相關(guān)抗氧化基因，包括編碼細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性抗氧化劑、Ⅱ相解毒酶和轉(zhuǎn)錄子的基因類決定細(xì)胞生存或死亡。受Nrf2調(diào)控的蛋白的持續(xù)表達(dá)對(duì)細(xì)胞氧化還原內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起到非常關(guān)鍵的作用，業(yè)已證實(shí)，許多天然或合成的小分子化合物可通過(guò)激活Nrf2/ARE途徑保護(hù)細(xì)胞免受有毒物或致癌物的傷害，因此，利用天然化合物或合成化合物激活Nrf2依賴的細(xì)胞對(duì)外源性毒劑的適應(yīng)性應(yīng)答，從而抵抗各種

8、病理?xiàng)l件下的應(yīng)激反應(yīng)，成為各種慢性病或癌癥預(yù)防的一個(gè)重要策略。本研究證實(shí)，染料木素對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降和凋亡有保護(hù)作用，并探討了Nrf2在染料木素介導(dǎo)的抗氧化作用中的分子機(jī)制。
　　 第一節(jié)染料木素對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞毒性的影響
　　 人體中即便是長(zhǎng)期攝入SI的人群中，血漿中的染料木素或大豆苷元的濃度很難達(dá)到μM，因此探討生理濃度的SI的生物學(xué)效應(yīng)顯得尤為重要且更加實(shí)際。為明確低濃度(生理濃度，nM

9、)的染料木素對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的保護(hù)作用，采用人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926，圍繞以過(guò)氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)或叔丁基過(guò)氧化氫(tert-butyl hydroperoxide，t-BHP)建立的EA.hy926細(xì)胞氧化應(yīng)激模型開(kāi)展研究，結(jié)果如下：
　　 1.H2O2或t-BHP均能計(jì)量依賴的誘導(dǎo)細(xì)胞活力下降，其IC50分別為650μM和75μM。
　　 2.染料木素(1 nM～

10、500 nM)可濃度依賴的抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降，其中100 nM～500 nM劑量組與對(duì)照組相比有顯著性差異。
　　 3.Annexin V-FITC流式細(xì)胞法和TUNEL熒光染色法均表明500 nM染料木素能降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。且染料木素可抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的Caspase-3蛋白表達(dá)升高和Bcl-2蛋白表達(dá)的降低。
　　 以上研究結(jié)果表明，低劑量(nM)的染料木素可減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，并可通過(guò)

11、抑制Caspase-3和上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡。
　　 第二節(jié)染料木素對(duì)EA.hy926細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化劑水平的影響
　　 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)是機(jī)體最重要的內(nèi)源性抗氧化酶，還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是機(jī)體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化劑。本節(jié)研究結(jié)果如下：
　　 1.染料木素(20 nM～500 nM

12、)可濃度依賴的上調(diào)SOD的水平，并抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的SOD水平的降低。
　　 2.染料木素(20 nM～500 nM)可濃度依賴的上調(diào)CAT的水平，并抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的CAT水平的降低
　　 3.染料木素(20 nM～500 nM)可濃度依賴的上調(diào)GSH的水平，并抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的GSH水平的降低。
　　 結(jié)果表明，染料木素對(duì)內(nèi)源性抗氧化劑的上調(diào)是其抗氧化作用的重要機(jī)制之一。
　　 第三節(jié)染料木素對(duì)NQO

13、1-ARE-Luc熒光素酶的活性的影響
　　 檢測(cè)染料木素對(duì)ARE-熒光素酶報(bào)告基因活性的影響，可以反應(yīng)直接反應(yīng)染料木素對(duì)Nrf2的激活作用。同樣對(duì)Nrf2的蛋白和mRNA水平以及核轉(zhuǎn)位進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如下：
　　 1.采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)，結(jié)果顯示染料木素(20 nM～500 nM)能濃度依賴的提高螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性。
　　 2.染料木素可上調(diào)Nrf2 mRNA表達(dá)水平，且在1h時(shí)就可激活Nrf2蛋

14、白的表達(dá)，并在1 h～10 h持續(xù)上調(diào)Nrf2的蛋白表達(dá)水平，但并不呈時(shí)間依賴性。
　　 3.染料木素(20 nM～500 nM)可濃度依賴的上調(diào)Nrf核蛋白的表達(dá)水平。
　　 以上研究結(jié)果表明，染料木素對(duì)Nrf2轉(zhuǎn)錄因子有激活作用。
　　 第四節(jié)染料木素對(duì)PPARy轉(zhuǎn)錄因子的激活作用
　　 檢測(cè)染料木素對(duì)PPREx3-熒光素酶報(bào)告基因的活性的影響直接反映了染料木素對(duì)PPARγ轉(zhuǎn)錄因子的激活作用。同樣圍繞

15、染料木素對(duì)PPARγ蛋白和mRNA表達(dá)水平以及核轉(zhuǎn)位進(jìn)行了研究。結(jié)果如下：
　　 1.采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)，結(jié)果顯示染料木素(20 nM～500 nM)可濃度依賴的提高螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性，但作用比較微弱。
　　 2.染料木素可增強(qiáng)PPARγ mRNA的表達(dá)，且可時(shí)間依賴(1 h～10 h)的上調(diào)PPARγ的蛋白表達(dá)水平。
　　 3.染料木素可促進(jìn)PPARγ的核蛋白水平的表達(dá)。
　　 以上研究結(jié)

16、果表明，染料木素對(duì)PPARγ轉(zhuǎn)錄因子有激活作用。
　　 第五節(jié)染料木素對(duì)血紅素加氧酶-1的激活效應(yīng)
　　 血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)對(duì)心血管系統(tǒng)有重要的保護(hù)作用，它同時(shí)受到Nrf2和PPARγ的調(diào)節(jié)，是這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子下游關(guān)鍵的抗氧化酶。本節(jié)研究染料木素對(duì)HO-1的影響，結(jié)果如下：
　　 1.免疫印跡結(jié)果顯示，染料木素(20 nM～500 nM)可劑量依賴和時(shí)間依賴的(1 h～1

17、0h)的上調(diào)HO-1的蛋白表達(dá)水平。
　　 2.Realtime PCR結(jié)果顯示，染料木素可時(shí)間依賴(1 h～10 h)的促進(jìn)HO-1 mRNA的表達(dá)水平。
　　 3.染料木素(20 nM～500 nM)可劑量依賴的增強(qiáng)HO-1的活性。
　　 以上研究結(jié)果表明了染料木素對(duì)HO-1的激活作用。
　　 第六節(jié)Nrf2、PPARy和HO-1在染料木素介導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)中的作用
　　 采用N

18、rf2-siRNA干擾、PPARγ的特異性拮抗劑GW9662和HO-1的特異性拮抗劑Znpp預(yù)處理細(xì)胞，研究染料木素對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的影響，結(jié)果如下：
　　 1.用FITC-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，siRNA對(duì)細(xì)胞有較高的轉(zhuǎn)染效率。
　　 2.免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組或染料木素處理組中，Nrf2-siRNA沉默了Nrf2的蛋白表達(dá)，而Control-siRNA對(duì)Nrf2蛋白表達(dá)沒(méi)有影響，說(shuō)

19、明Nrf2-siRNA轉(zhuǎn)染能有效沉默Nrf2基因的表達(dá)。
　　 3.Nrf2-siRNA處理消除了染料木素對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降的抑制作用，Control-siRNA處理則無(wú)此作用。
　　 4.GW9662和Znpp特異性拮抗劑的分別處理細(xì)胞削弱了染料木素對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降的保護(hù)作用。
　　 以上研究結(jié)果表明，Nrf2在染料木素抵抗細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮了重要的作用，PPARγ和HO-1也在一定程

20、度上介導(dǎo)了染料木素的抗氧化效應(yīng)。
　　 第二部分 Nrf2在雌馬酚抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞毒性中的作用機(jī)制研究
　　 雌馬酚(Equol)是人體腸道細(xì)菌以大豆苷元為底物合成的專一性產(chǎn)物和最終代謝產(chǎn)物，人群中有30～50%的成年人不能代謝生成雌馬酚，且這種個(gè)體差異持續(xù)的存在于“雌馬酚產(chǎn)生者”(Equol producers，Eq+)和“非雌馬酚產(chǎn)生者”(Equol non-producers，Eq-)中，調(diào)查發(fā)

21、現(xiàn)亞洲人中Eq+的比例明顯高于西方人，提示Eq+較Eq-罹忠心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)更低。由于具有特殊的分子結(jié)構(gòu)，雌馬酚的抗氧化活性、雌激素受體結(jié)合能力和啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄活性比其前體更強(qiáng)。而在體內(nèi)，49.7%的循環(huán)雌馬酚以游離或非結(jié)合形式存在，顯著高于游離大豆苷元(18.7%)或游離雌二醇(4.6%)，且在血漿中有更長(zhǎng)的半衰期，令雌馬酚能夠有效的發(fā)揮其藥理作用。因此，雌馬酚優(yōu)良的抗氧化特性和廣泛的生物學(xué)效應(yīng)提示其被用于防治心血管疾病中的可能。

22、>　　 第一節(jié)雌馬酚對(duì)NQO1-ARE-Luc熒光素酶的調(diào)節(jié)
　　 利用業(yè)已建立的基于ARE-熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)Nrf2小分子激動(dòng)劑篩選細(xì)胞模型，檢測(cè)雌馬酚對(duì)ARE-熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的影響，直接反映其對(duì)Nrf2的激活作用。研究結(jié)果如下：
　　 1.采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)，結(jié)果顯示，雌馬酚可劑量依賴(10 nM～250 nM)和時(shí)間依賴(0.5 h～2 h)的增強(qiáng)ARE-熒光素酶的活性。
　　 以上研究結(jié)果證明

23、，雌馬酚是一個(gè)Nrf2轉(zhuǎn)錄因子激動(dòng)劑。
　　 第二節(jié)雌馬酚對(duì)Nrf2及其下游分子HO-1和NQO1蛋白和mRNA水平的影響
　　 本節(jié)圍繞雌馬酚對(duì)Nrf2及受其調(diào)控的抗氧化基因醌氧化還原酶(NAD(P)H quinineoxidoreductase1，NQO1)和HO-1的蛋白和mRNA水平的影響進(jìn)行研究。結(jié)果如下：
　　 1.免疫印跡結(jié)果顯示，雌馬酚(10 nM～250 nM)可劑量依賴的提高Nrf2、HO-1

24、和NQO1的蛋白表達(dá)水平，同樣，500 nM染料木素和大豆苷元處理均能提高Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表達(dá)水平。
　　 2.用HA-Nrf2表達(dá)型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，雌馬酚(10 nM～250nM)濃度依賴的上調(diào)HA、Nrf2、HO-1和NQO1蛋白水平的表達(dá)。
　　 3.Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，雌馬酚對(duì)Nrf2 mRNA影響不顯著，但可濃度依賴(10 nM～250 nM)的上調(diào)H

25、O-1和NQO1 mRNA的表達(dá)水平。
　　 以上研究結(jié)果表明，雌馬酚主要通過(guò)上調(diào)Nrf2蛋白水平激活Nrf2/ARE信號(hào)通路。
　　 第三節(jié)ER、ERK1/2和PI3K/Akt在雌馬酚激活Nrf2轉(zhuǎn)錄因子中的作用機(jī)制研究
　　 分別采用ER、ERK1/2和PI3K/AktI的特異性拮抗劑CI182，780、PD98059和LY294002預(yù)處理細(xì)胞，研究雌馬酚、大豆苷元和染料木素對(duì)Nrf2轉(zhuǎn)錄因子的影響，結(jié)果如

26、下：
　　 1.免疫印跡結(jié)果顯示，ICI182，780、PD98059和LY294002處理對(duì)雌馬酚對(duì)Nrf2蛋白水平的上調(diào)作用的影響不明顯，但I(xiàn)CI182，780和LY294002處理抑制了對(duì)雌馬酚對(duì)HO-1和NQO1的上調(diào)作用，而PD98059處理對(duì)這兩種基因表達(dá)影響不明顯；ICI182，780、PD98059和LY294002處理抑制了大豆苷元對(duì)Nrf2和HO-1蛋白水平的上調(diào)，ICI182，780和LY294002處理抑

27、制了大豆苷元對(duì)NQO1的上調(diào)作用，但PD98059處理對(duì)NQO1影響不明顯；PD98059處理對(duì)染料木素對(duì)Nrf2的上調(diào)作用沒(méi)有影響，ICI182，780和LY294002處理則抑制了染料木素對(duì)Nrf2的上調(diào)作用，PD98059和LY294002處理抑制HO-1和NQO1的上調(diào)表達(dá)，但I(xiàn)CI182，780處理對(duì)HO-1和NQO1表達(dá)沒(méi)有影響。
　　 2.采用HA-Nrf2表達(dá)型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，未經(jīng)

28、轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細(xì)胞中無(wú)HA表達(dá)，經(jīng)HA-Nrf2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)HA主要熒光增強(qiáng)，但主要表達(dá)在胞漿內(nèi)。Equol處理能明顯誘導(dǎo)HA的核轉(zhuǎn)位。PD98059預(yù)處理使HA在胞漿中的表達(dá)減弱，但仍然主要表達(dá)與胞核。LY294002和ICI182，780分別處理抑制HA在胞核中的表達(dá)。
　　 3.免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示，雌馬酚、大豆苷元和染料木處理可誘導(dǎo)Nrf2的核轉(zhuǎn)位。LY294002或ICI182，780預(yù)處理抑制雌馬酚誘導(dǎo)的

29、Nrf2核轉(zhuǎn)位。PD98059處理對(duì)Nrf2核轉(zhuǎn)位或熒光強(qiáng)度均沒(méi)有顯著影響。LY294002或ICI182，780預(yù)處理可抑制大豆苷元或染料木素誘導(dǎo)的Nrf2核轉(zhuǎn)位。PD98059處理可抑制大豆苷元誘導(dǎo)的Nrf2的表達(dá)但對(duì)核轉(zhuǎn)位沒(méi)有影響。PD98059處理可抑制染料木素誘導(dǎo)的的Nrf2核轉(zhuǎn)位。
　　 4.用ARE熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，LY294002或ICI182，780預(yù)處理顯著

30、抑制了雌馬酚對(duì)熒光素酶的活性的上調(diào)，PD98059預(yù)處理對(duì)雌馬酚誘導(dǎo)的熒光素酶的活性無(wú)影響。
　　 以上研究結(jié)果表明，雌馬酚可能通過(guò)ER和PI3K/Akt但不通過(guò)ERK1/2途徑激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，大豆苷元和染料木素對(duì)Nrf2的激活可能通過(guò)ER和PI3K/Akt途徑，大豆苷元對(duì)Nrf2的激活不通過(guò)ERK1/2，而染料木素對(duì)Nrf2的激活可能通過(guò)ERK1/2。
　　 第四節(jié)雌馬酚的抗氧化效應(yīng)評(píng)估
　　 本

31、節(jié)圍繞雌馬酚的抗氧化作用開(kāi)展研究，結(jié)果如下：
　　 1.250 nM雌馬酚預(yù)處理對(duì)不同濃度H2O2(100μM～800μM)和t-BHP(20μM～80μM)處理組細(xì)胞活力的下降均有不同程度的抑制作用。
　　 2.氧化應(yīng)激處理使內(nèi)皮細(xì)胞中ROS水平明顯升高，雌馬酚單獨(dú)處理對(duì)ROS水平?jīng)]有顯著影響。雌馬酚預(yù)處理可明顯抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞中的ROS水平的升高。
　　 3.Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞和

32、TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示，H2O2處理使內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，Equol預(yù)處理可抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　 4.免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，Control-siRNA處理對(duì)雌馬酚對(duì)Nrf2蛋白的上調(diào)作用沒(méi)有影響，Nrf2-siRNA處理則沉默了雌馬酚對(duì)Nrf2蛋白的上調(diào)作用。
　　 5.對(duì)細(xì)胞的活力檢測(cè)結(jié)果顯示，Control-siRNA干擾對(duì)雌馬酚對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用沒(méi)有影響，而Nrf2-siRN