脂聯(lián)素對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:通過原代培養(yǎng)SD大鼠的乳鼠心肌細(xì)胞建立過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞衰老模型，探討脂聯(lián)素(adiponectin，APN)對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老的影響及線粒體自噬在其中的參與機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.采用酶消化法，結(jié)合差速貼壁法和化學(xué)試劑(5-brdu)抑制法分離純化SD大鼠乳鼠心室肌細(xì)胞，分離的心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。使用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)和自發(fā)搏動情況，并通過

2、α-肌動蛋白免疫熒光法對培養(yǎng)心肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　 2.選用培養(yǎng)72小時的單層心肌細(xì)胞，隨機(jī)分為5組:(1)對照組:心肌細(xì)胞正常培養(yǎng);(2)過氧化氫組（H2O2組）:培養(yǎng)基中加入終濃度為30μmol/L的H2O2培養(yǎng)2小時誘導(dǎo)心肌細(xì)胞衰老;(3)過氧化氫+脂聯(lián)素組（H2O2+APN組）:培養(yǎng)基中加入終濃度為30mg/L脂聯(lián)素與心肌細(xì)胞共同孵育48小時后，再加入H2O2誘導(dǎo)衰老;(4)過氧化氫+脂聯(lián)素+阿糖腺苷組（H2O2+AP

3、N+AraA組）:培養(yǎng)基中加入終濃度分別為30mg/L脂聯(lián)素和1mmol/LAraA與心肌細(xì)胞共同孵育48小時后，再加入H2O2誘導(dǎo)衰老;(5)過氧化氫+糖腺苷組（H2O2+AraA組）:加入1 mmol/LAraA與心肌細(xì)胞共同孵育48小時后，再加入H2O2誘導(dǎo)衰老。
　　 3.實(shí)驗終止后，使用衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色陽性作為計數(shù)衰老心肌細(xì)胞的指標(biāo)。
　　 4.通過Western blot檢測各組

4、線粒體自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.細(xì)胞鑒定:倒置顯微鏡下可見細(xì)胞成簇生長，有規(guī)律的自發(fā)性搏動，頻率約90-120次/分。熒光倒置顯微鏡下可見胞漿內(nèi)呈現(xiàn)綠色熒光，即胞漿內(nèi)表達(dá)α-肌動蛋白，符合心肌細(xì)胞的特征。
　　 2.衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色結(jié)果:與對照組相比，H2O2組心肌細(xì)胞SA-β-gal染色陽性率明顯增加(P＜0.05)。與H2O2組相比，H2O2+APN

5、組SA-β-gal染色陽性率明顯下降，差異顯著(P＜0.05)。H2O2+APN+AraA組較H2O2+APN組染色陽性率增加，有顯著性差異(P＜0.05)。H2O2+AraA組與H2O2組相比，染色陽性率增加，無顯著性差異(P＞0.05)。即APN預(yù)處理可明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老，這一作用可以被AMPK途徑抑制物AraA部分阻斷。
　　 3.Western blot檢測線粒體自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)情況:與H2O2組

6、相比，H2O2+APN組LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)明顯增加(P＜0.05)。H2O2+APN+AraA組較H2O2+APN組LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)下降，有顯著性差異(P＜0.05)。即APN可增強(qiáng)線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，加入AMPK途徑抑制物后這一作用減弱。
　　 結(jié)論:
　　 1.H2O2可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞衰老。
　　 2.脂聯(lián)素可抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的衰老，同時可以增強(qiáng)心肌細(xì)胞的線粒體自噬作用。
　　 3.加